玉米秸稈為原料燃料乙醇制備的關(guān)鍵問題研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源，被認(rèn)為是最重要的乙醇生產(chǎn)的后續(xù)資源物質(zhì)。但在以木質(zhì)纖維素為原料進(jìn)行乙醇制備方面仍存在原料預(yù)處理技術(shù)難、纖維素酶水解成本高和木糖尚無法被利用產(chǎn)酒精等問題，纖維素乙醇的價(jià)格尚無法與糧食乙醇競(jìng)爭(zhēng)，解決纖維素乙醇制備過程中的關(guān)鍵技術(shù)已成為全世界共識(shí)。本論文針對(duì)目前制約木質(zhì)纖維素物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的主要技術(shù)瓶頸，在原料預(yù)處理、纖維素降解菌群在纖維素酒精生產(chǎn)中的應(yīng)用和木糖利用方面進(jìn)行以下研究：
　　根據(jù)

2、微波加熱的基本原理，結(jié)合預(yù)處理的目標(biāo)和特點(diǎn)，將微波引入秸稈的預(yù)處理過程，對(duì)不同的吸波介質(zhì)進(jìn)行了比較和選擇，確定水是對(duì)纖維素酶毒性最小、預(yù)處理效果較好且環(huán)保經(jīng)濟(jì)的吸波介質(zhì)。優(yōu)化出微波預(yù)處理玉米秸稈的工藝參數(shù)為液固比為58:1，微波功率為630 W，處理時(shí)間為5.5分鐘，在該條件下，微波預(yù)處理玉米秸稈的酶解率可達(dá)到49.12％。應(yīng)用原子力顯微鏡(AFM)觀察微波水預(yù)處理前后的秸稈表面形貌，結(jié)合本研究中預(yù)處理前后秸稈成分的變化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)微波預(yù)

3、處理是利用水分子在秸稈表面“鉆孔”從而增大秸稈與纖維素酶的接觸面積，也使得纖維素酶容易進(jìn)入秸稈內(nèi)部進(jìn)行水解從而達(dá)到提高酶解效率的目的。
　　從自然環(huán)境中分離篩選出高效產(chǎn)酶且酶活穩(wěn)定的纖維素降解菌株 FLZ6和FLZ10，采用形態(tài)學(xué)、生理生化和微生物細(xì)胞膜脂肪酸特異性分析，鑒定FLZ6為地衣芽孢桿菌(Bacillus-licheniformis)，F(xiàn)LZ10為毛殼菌(Chaetomium spp）。應(yīng)用FLZ6和FLZ10構(gòu)建纖維素

4、降解菌群代替纖維素酶使用，進(jìn)行同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)生產(chǎn)乙醇的研究，通過測(cè)定反應(yīng)體系中的乙醇含量，對(duì)SSF工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了 SSF工藝的最佳條件為：反應(yīng)溫度37℃，初始 pH6.0，纖維素降解菌群和酵母菌的比例為1:1，反應(yīng)時(shí)間36小時(shí)。在該條件下，獲得了13.1 g/100 g秸稈的乙醇。
　　從富含豐富的腐爛纖維素的土壤中分離篩選出一株木糖發(fā)酵酵母菌株FL-20-2。采用形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法將這株菌鑒定為

5、假絲酵母屬中的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。在確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組份(木糖50 g/L，酵母粉0.5 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4.7H2O0.4 g/L)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行菌株代謝特性分析。發(fā)現(xiàn)FL20-2在以木糖為唯一碳源時(shí)，pH5.5，溫度35℃，接種量為10%的厭氧條件下培養(yǎng)96 h，乙醇產(chǎn)量最高，為其利用木糖生成乙醇理論產(chǎn)量的32.4%，此時(shí)伴有31.05 g/L的木糖醇生成。在以木糖和葡

6、萄糖的混合糖為碳源時(shí)，相同發(fā)酵條件下，木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化的乙醇產(chǎn)量分別為其理論產(chǎn)量的37.7%和79.2%，同時(shí)伴有30.2 g/L的木糖醇產(chǎn)生。采用纖維素降解菌群和熱帶假絲酵母混合，對(duì)經(jīng)過微波預(yù)處理的玉米秸稈進(jìn)行乙醇制備研究，在纖維素降解菌群和熱帶假絲酵母菌按體積比1:1，10％接種量，溫度為40℃，時(shí)間84 h條件下，乙醇產(chǎn)量為17.9 g/100g玉米秸稈，同時(shí)伴有10.05 g/100 g玉米秸稈的木糖醇生成。
　　通過對(duì)假

7、絲酵母菌屬(Candida sp.)木糖還原酶基因序列保守區(qū)域的分析，設(shè)計(jì)了一系列引物，以近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)的總RNA為模板，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法成功獲取了Candida parapsilosis木糖還原酶基因，其開放閱讀框長(zhǎng)度為954 bp，使用Blastn程序進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn)與白色假絲酵母(Candida albicans)的醛糖

8、還原酶(aldose reductase，XM715658)同源性最高，相似性為80%，通過進(jìn)化關(guān)系分析認(rèn)定本文發(fā)現(xiàn)了一種新的木糖還原酶基因，其登錄號(hào)為：EF033247。選用巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA為載體，將獲得的木糖還原酶基因開放閱讀框克隆該表達(dá)載體pGAP啟動(dòng)子下，構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒同源重組到畢赤酵母基因組上進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物采用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化，得到約36-kDa蛋白條帶。酶學(xué)性質(zhì)的分析表明，

9、重組蛋白具有較高的木糖催化效率(kcat/Km=61/mM/min)和不同于其它木糖還原酶的輔酶特性，其依賴于NADH的催化效率(kcat/Km=41.5/μM/min)大于依賴于NADPH的催化效率(kcat/Km=2.2/μM/min)。
　　本論文通過上述研究，基本確定了以玉米秸稈為原料進(jìn)行乙醇制備的工藝過程，采用本論文的技術(shù)，可獲得17.9 g乙醇/100g玉米秸稈這一較高的乙醇產(chǎn)量；同時(shí)通過對(duì)木糖利用關(guān)鍵酶-木糖還原酶的