廢水處理系統(tǒng)中重要功能類群Thauera屬種群結構與功能的研究.pdf

1、在廢水生物處理系統(tǒng)中,污染物的去除主要是由其中的微生物群落完成的,微生物群落的結構和功能往往決定了整個裝置的性能。Thauera屬細菌就是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中并具有多種芳香族污染物降解能力的重要功能類群,深入研究其種群組成與降解功能,具有重要的理論意義和應用價值。
　　 由于分離比較困難、缺少專一性的分子檢測方法,人們對于廢水處理系統(tǒng)中Thauera屬種群的結構與功能的了解還非常有限。
　　 為此,本論

2、文建立了Thauera特異性、嵌套式PCR-DGGE(denaturinggradient gel electrophorcsis)的方法用于環(huán)境樣品中Thauera種群結構的研究。對一個來自廢水處理系統(tǒng)的生物膜樣品以Thauera特異性PCR擴增產物建立了克隆文庫,所有測序的克隆(91個)都屬于Thauera屬,說明該PCR方法具有很高特異性。為了快速簡便的比較不同樣品中Thauera的結構,以特異性PCR擴增產物為模板進行16S r

3、RNA基因V3區(qū)嵌套式擴增后用于DGGE分析,建立了Thauera特異性PCR-DGGE方法。13個帶有不同V3序列的克隆在DGGE上形成了10條條帶,說明該方法具有較高的分辨率,可以用于檢測樣品中的Thauera屬的組成。
　　 在一個大型焦化廢水處理裝置由于回流泵機械故障而導致化學需氧量(COD)去除率逐漸降低時,我們使用建立的特異性PCR-DGGE方法對系統(tǒng)中Thauera的結構變化進行了追蹤監(jiān)測。對DGGE指紋圖譜進行主

4、成份分析(PCA)后,發(fā)現(xiàn)當系統(tǒng)COD的去除率從前4周的84.1±2.7％降到第5和第6周的低于75％時,Thauera種群結構呈現(xiàn)出相應的時間演替軌跡,表明Thauera種群結構的變化與系統(tǒng)COD去除功能的波動密切相關。
　　 為了分離焦化廢水處理系統(tǒng)中常規(guī)方法難以分離的Thauera細菌,我們設計了一套以Thauera特異性16S rRNA基因為靶向的分離方法。根據(jù)已知Thauera的代謝特性及目標菌的生活環(huán)境,設計了6種培

5、養(yǎng)基,并使用Thauera特異性PCR-DGGE方法對焦化廢水處理裝置反硝化池樣品在不同培養(yǎng)條件下獲得的Thauera多樣性進行了分析。選取多樣性較高的培養(yǎng)基1/10 NB與MMQ在好氧條件下進行分離培養(yǎng)。以Thauera特異性PCR方法篩選陽性菌落,并用DGGE方法檢驗菌落的純度。將含有Thauera的混合菌落在不同的選擇性培養(yǎng)基上多次劃線,使用特異性PCR及DGGE方法追蹤含有Thauera的菌落并分析其純度,最終從反硝化池樣品中純

6、化獲得了3株Thauera菌株(Q4、3-35和Q20-C)。這種以特異性分子標記為靶向分離培養(yǎng)細菌的方法,提高了細菌篩選的靈敏度,可協(xié)助分離常規(guī)方法難以分離的細菌。
　　 隨后,對這3株Thauera菌株的基因及其污染物降解能力進行了比較分析。測序結果表明這3株Thauera細菌具有相同的16S rRNA基因,但是它們的ERIC-PCR基因組指紋圖譜卻存在顯著差異(相似性<65％)。使用氣相色譜-質譜(GC/MS)聯(lián)用技術對這

7、3株菌的污染物降解能力進行了測定。好氧條件下,它們能降解焦化廢水中除喹啉外的所有主要有機污染物(苯酚、甲酚、二甲酚及吲哚等),但苯酚降解速度卻各不相同(Q4>3-35>Q20-C)。在已知的8個Thauera種中,只有T.phenylacetia能在好氧條件下降解其中的一種污染物(苯酚)。雖然Q20-C含有亞硝酸鹽還原酶基因(nirS),但這3株菌都沒有顯現(xiàn)出反硝化能力,而已知的Thauera細菌則都是反硝化菌。以上結果表明,這3個從焦

8、化廢水處理裝置中分離到的細菌可能代表了一種新的Thauera類型,具有廣泛的芳香族污染物降解能力。
　　 為了了解Thauera屬細菌在廢水處理脫氮過程中的作用,我們研究了8個不同來源的Thauera菌株(T.aminoaromatica、T.linaloolentis、T.phenylacetica、T.terpenica、Thauera sp.DNT-1、Thauera sp.27、Thauera
　　 sp.28及

9、Thauera sp.63)的反硝化功能及基因。反硝化過程中,所有Thauera均只產生少量的NO(<50 nmol/flask；<32.9 nM in liquid)。除T.phenylacefica外,其余Thauera菌株都可將硝態(tài)氮徹底轉化為氮氣。PCR分析后發(fā)現(xiàn)T.phenylacetica缺失了N2O還原酶(nos)基因,使它的反硝化終產物為N2O。對T.aminoaromatica在不同pH、O2及NOx條件下的反硝化過程

10、進行分析后發(fā)現(xiàn),在pH7-9范圍內,隨著pH的升高,積累的中間產物(NO和N2O)會減少。相比于NO-3,以NO-2作為電子受體,不僅使得積累的N2O量顯著升高(6-40倍),還使其開始反硝化的O2濃度從<0.8μM提高到了>4μM。這說明NO-2能誘導T.aminoaromatica反硝化基因的表達。在反硝化進行時,只有N2O還原酶的活性會被O2立刻抑制,而其他反硝化酶的活性基本不受的影響。這進一步闡明了氧氣調控反硝化過程的機制。