鼠Hlx基因修飾樹(shù)突狀細(xì)胞系的建立及其功能的初步研究.pdf

1、目的：為探討轉(zhuǎn)錄因子Hlx在樹(shù)突狀細(xì)胞中的作用，我們了構(gòu)建攜帶小鼠Hlx基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-mHlx-EGFP，轉(zhuǎn)染鼠樹(shù)突狀細(xì)胞系，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hlx的小鼠DC2.4細(xì)胞株，通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)研究過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hlx的樹(shù)突狀細(xì)胞株在生物學(xué)行為和功能的改變，作為一種工具細(xì)胞株為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)采用PCR方法，以Hlx含有基因的PGEM-T質(zhì)粒為模板擴(kuò)增mHlx基因，將

2、mHlx基因克隆至pIRES2-EGFP真核載體，通過(guò)PCR，雙酶切篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行序列測(cè)定。
　　 (2)將測(cè)序正確的pIRES2-mHlx-EGFP載體應(yīng)用脂質(zhì)體的方法(質(zhì)粒(μg)∶脂質(zhì)體(1μl)=1:3)轉(zhuǎn)染DC2.4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過(guò)600μg/ml G418篩選和EGFP的表達(dá)，并經(jīng)過(guò)單克隆化生長(zhǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的抗性DC2.4細(xì)胞株。再應(yīng)用RT-PCR、Western-blot篩選出高表達(dá)Hlx的克隆株

3、。
　　 (3)應(yīng)用real-time PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平比較不同細(xì)胞株DC2.4、DC2.4/EGFP、DC2.4/Hlx中的T-bet、GA TA3、Ifn-γ、Il-4、Il-12p40、Il-12p35、Il-6的表達(dá)變化；再應(yīng)用ELISA的方法在蛋白水平對(duì)不同細(xì)胞株培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12P70進(jìn)行檢測(cè)。
　　 (4)應(yīng)用PE標(biāo)記的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86、TLR

4、4、CCR7單克隆抗體(5μg/ml)對(duì)不同細(xì)胞株進(jìn)行染色，再應(yīng)用FACS分析表面分子的變化。
　　 (5)DC2.4、DC2.4/EGFP和DC2.4/Hlx分別和表達(dá)紅色熒光蛋白HcRed并且應(yīng)用3％多聚甲醛固定處死的大腸埃希菌37℃共培養(yǎng)2h，同時(shí)在4℃做平行對(duì)照作為背景扣除非特異性吸附和設(shè)定LPS刺激組作為陽(yáng)性對(duì)照，F(xiàn)ACS分析過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hlx對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬的影響。
　　 (6)抗原提呈功能分析：DC2.4

5、、DC2.4/EGFP、DC2.4/Hlx用100mg/L的OVA刺激24h，然后30 mg/L絲裂霉素37℃處理20分鐘，預(yù)冷的PBS洗滌兩次備用。無(wú)菌分離預(yù)先應(yīng)用OVA免疫過(guò)的C57BL/6小鼠脾臟，應(yīng)用MACS分離CD4+T細(xì)胞，3 mmol/L CFSE染色后備用。于24孔板一個(gè)培養(yǎng)孔中接種2×106個(gè)CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞和2×105個(gè)樹(shù)突狀細(xì)咆共培養(yǎng)三天后FACScalibur分析CD4+T細(xì)胞分裂；另外于96孔板中每

6、孔接種2×105個(gè)未標(biāo)記CD4+T細(xì)胞和2×104個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)，三天后MTT法檢測(cè)增殖。兩組中均設(shè)空白和陽(yáng)性對(duì)照。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體PIRES2-mHlx-EGFP，經(jīng)PCR，雙酶切鑒定均與目的片段大小相符；序列測(cè)定結(jié)果顯示與GenBank中(NM008250.1)鼠Hlx基因序列完全一致。
　　 (2)PIRES2-mHlx-EGFP和PIRES2-EGFP分別轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞

7、株DC2.4經(jīng)G418抗性篩選得到抗性細(xì)胞株，經(jīng)FACS，RT-PCR，Western-blot鑒定成功建立DC2.4/mHlx，DC2.4/EGFP細(xì)胞株。
　　 (3)RT-PCR檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)Hlx的DC2.4/Hlx和DC2.4/EGFP、DC2.4相比，Ifn-γ、Il-12p35、Il-12p40、Il-6轉(zhuǎn)錄均增加，而轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3無(wú)明顯差異；Il-4無(wú)表達(dá)。ELISA結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因

8、子IFN-γ和IL-12p70分泌增加。
　　 (4)表面分子分析顯示過(guò)表達(dá)Hlx的DC2.4相較于DC2.4/EGFP，DC2.4表面分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，共刺激分子CD80、CD86、CD40表達(dá)均增加，而TLR4表達(dá)水平很低且差別不明顯，CCR7無(wú)表達(dá)。
　　 (5)吞噬能力分析表明，與正常DC2.4比較：DC2.4/Hlx細(xì)胞吞噬能力明顯下降，DC2.4/EGFP細(xì)胞吞噬能力也稍有減弱，而LPS刺激組則無(wú)十

9、分明顯改變?？乖岢誓芰Ψ治鲲@示，DC2.4/Hlx可以更有效地提呈抗原給T細(xì)胞，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)論：
　　 (1)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體PIRES2-mHlx-EGFP。
　　 (2)建立過(guò)表達(dá)鼠HLx基因樹(shù)突狀細(xì)胞系DC2.4/mHlx和對(duì)照細(xì)胞系DC2.4/EGFP。
　　 (3)功能研究發(fā)現(xiàn)，在未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞系DC2.4中過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hlx，可以促進(jìn)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)