細(xì)胞思考題2015粗制版

1、定量檢測(cè)幾十萬(wàn)個(gè)分散的細(xì)胞的定量檢測(cè)幾十萬(wàn)個(gè)分散的細(xì)胞的DNADNA含量含量應(yīng)用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)（FCM）1.收集單細(xì)胞懸液(1106個(gè))，緩慢加入1ml預(yù)冷的70％乙醇，于4℃固定過(guò)夜，或20℃長(zhǎng)期固定。2離心收集細(xì)胞，再以1mlPBS徹底洗去乙醇；3去上清后加入染色液(包含50ugmlPI，100ugmlRNaseA，0.2%TritonX100)，37℃染色30min后上機(jī)檢測(cè)。4DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒

2、光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)以及此處的某種蛋白顆?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)以及此處的某種蛋白顆?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)及蛋白顆粒要用透射電鏡。定量檢測(cè)一批光鏡切片上含有某種蛋白質(zhì)的細(xì)胞的數(shù)目定量檢測(cè)一批光鏡切片上含有某種蛋白質(zhì)的細(xì)胞的數(shù)目首先對(duì)切片上的全部細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)目的蛋白的熒光探針特異性標(biāo)記（熒光染色，熒光標(biāo)記抗體，外源導(dǎo)入熒光蛋白），同時(shí)對(duì)細(xì)胞行核復(fù)

3、染。再以熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。熒光探針的特異性標(biāo)記：即熒光強(qiáng)度與特異性標(biāo)記蛋白的表達(dá)量成正相關(guān)了解細(xì)胞發(fā)生死亡時(shí)的形態(tài)學(xué)和某個(gè)酶的改變了解細(xì)胞發(fā)生死亡時(shí)的形態(tài)學(xué)和某個(gè)酶的改變首選以流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)對(duì)檢測(cè)細(xì)胞以AnnexinVPI雙染法或亞二倍體(SubG1)峰的檢測(cè)分選出凋亡細(xì)胞。再熒光標(biāo)記凋亡細(xì)胞的要檢查的酶，以激光掃描共聚焦顯微鏡觀察酶的變化。對(duì)細(xì)胞電子染色后以掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。了解某個(gè)新基因所編碼的蛋白質(zhì)的功

4、能了解某個(gè)新基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能1.首選以Nthernblot檢測(cè)該蛋白在各組織中的表達(dá)。選出表達(dá)豐度最高組織細(xì)胞。2設(shè)立該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，從中篩選出與該蛋白有相互作用的蛋白（編碼基因）。3.以酵母雙雜交法及GSTpulldown方法對(duì)所篩選蛋白做驗(yàn)證。4.由所篩選出的蛋白功能來(lái)分析推測(cè)該蛋白功能并用分子生化技術(shù)及細(xì)胞生化技術(shù)檢測(cè)。透射電子透射電子當(dāng)樣品厚度小于100nm時(shí)，部分電子可穿透樣品，將穿透樣品的電子叫做透射電子，

5、利用透射電子信息成像的電子顯微鏡稱為透射電鏡。二次電子二次電子在入射電子的轟擊下，樣品表面5～50nm深度激發(fā)出來(lái)的電子稱為二次電子，利用二次電子信息成像的電子顯微鏡稱為掃描電鏡。電子顯微鏡：電子顯微鏡：電子顯微鏡鏡以電子射線作為照明源，以電磁場(chǎng)作為透鏡，具有高分辨率和放大倍率的顯微鏡。電鏡用于研究組織和細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。分辨率分辨率表示人眼和光學(xué)儀器能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的標(biāo)志。免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)是將免疫學(xué)方法與電子

6、顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，利用抗原與抗體特異結(jié)合的特性，在超微結(jié)構(gòu)水平定位特異大分子的技術(shù)。負(fù)顯性突變：負(fù)顯性突變：對(duì)影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的功能。DNADNAmicroarraymicroarray：是一種用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高通量技術(shù).它由一系列成千上萬(wàn)個(gè)精微的DNA寡核苷酸點(diǎn)排列而成，這些DNA寡核苷酸含有百億分之一摩爾特定序列的。它們或者是一小截基因，或者是DNA的

7、其他成分。它們被作為探針，在非常嚴(yán)格的條件下和一個(gè)叫做靶分子的cDNA或cRNA樣本雜交。由于靶分子帶有熒光標(biāo)記，因此通過(guò)探針靶分子的雜交，并根據(jù)雜交后熒光的有或無(wú)，強(qiáng)或弱，對(duì)靶分子中特定核酸序列的豐度進(jìn)行檢測(cè)。共激活因子共激活因子：是一種蛋白，本身不能與DNA結(jié)合，但能夠通過(guò)與具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的激活因子（或轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合來(lái)增強(qiáng)基因的表達(dá)。共激活因子可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的許多其他過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)、終止、RNA剪接以及激活因子和共激活因子復(fù)合

8、體的降解等。報(bào)告基因報(bào)告基因:是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。sisiRNA(smallRNA(smallinterferinginterferingRNA)RNA)：也被稱為短干擾RNA(shtinterferingRNA)或沉默RNA

9、(silencingRNA)，通常為人工合成的長(zhǎng)約20到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，利用其可與特定信使RNA（mRNA）發(fā)生同源性結(jié)合并使之降解的特點(diǎn)，誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因發(fā)生沉默，從而阻斷特定基因的表達(dá)。具有靶向、高效、易于操作的特點(diǎn)，是一種研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的新技術(shù)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIPCHIP）:研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為

10、一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSAEMSA）:是一種研究核酸結(jié)合蛋白和其相關(guān)的核酸結(jié)合序列相互作用的技術(shù)。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA蛋白復(fù)