基因工程復(fù)習(xí)資料

1、1基因工程的概念基因工程的概念利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過(guò)一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過(guò)程.2蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程的概念在基因工程技術(shù)對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因的了解基礎(chǔ)上，對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，進(jìn)而通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和翻譯后的修飾等手段改變甚至創(chuàng)造出新的和更有效

2、的蛋白質(zhì)。2.1蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo)蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析，蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)和分析，蛋白質(zhì)組分析3.基因工程的誕生基因工程誕生于1973年，它是數(shù)十年來(lái)無(wú)數(shù)科學(xué)家辛勤勞動(dòng)的成果、智慧的結(jié)晶。從40年代開(kāi)始，科學(xué)家們從理論和技術(shù)兩方面為基因工程的產(chǎn)生奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。概括起來(lái)，從40年代到70年代初的基因工程誕生，在現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)明及技術(shù)上的三大發(fā)明對(duì)基因工程的誕生起到了決定性的作用3.1理論上的

3、三大發(fā)現(xiàn)（1）40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA.(2）50年代搞清楚了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。（3）60年代確定了遺傳信息的傳遞方式。確定遺傳信息是以密碼方式傳遞的，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸。3.2技術(shù)上的三大發(fā)明（1）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（2）對(duì)基因工程技術(shù)的突破的另一發(fā)現(xiàn)是DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)（3）基因工程載體的發(fā)現(xiàn)3.3基因工程的里程碑1973年，斯坦福大學(xué)的SCohen等人，也成功地進(jìn)行了另一個(gè)

4、體外重組實(shí)驗(yàn)并實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。他們將大腸桿菌(EColi)的抗四環(huán)素(TCr)質(zhì)粒PSCl01和抗新霉索(Ner)及抗磺胺(Sr)的質(zhì)粒R6一3，在體外用限制性內(nèi)切酶EcI切割，連接成新的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。結(jié)果在含四環(huán)素和新霉素的平板中，選出了抗四環(huán)素和抗新霉素的重組菌落這是基因工程發(fā)展史上第一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的例子?；蚬こ虖拇苏Q生，這一年被定為基因工程誕生的元年。4。限制性內(nèi)切酶的分類I型：識(shí)別特定序列，切

5、割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)至少1000bp處隨機(jī)切割I(lǐng)I型：識(shí)別特定序列并在識(shí)別位點(diǎn)處或附近切割I(lǐng)II型：識(shí)別特定序列，切割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)3’端25~27bp處隨機(jī)切割限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特點(diǎn)1.絕大多數(shù)酶的識(shí)別序列是特異的，僅有少數(shù)有變動(dòng)2.識(shí)別序列一般為4~6個(gè)堿基對(duì)，一般都富含GC3.大多數(shù)識(shí)別序列具有180旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)（Palindrome）限制性內(nèi)切酶的切割方式DNA經(jīng)限制酶切后，產(chǎn)生2種類型的末端粘性末端(stickyend)

6、和平整末端(bluntend)◇３’端突起sticky3’end◇５’端突起sticky5’end◇平整末端bluntendBal31核酸酶分離自AlteromonasespejianaBAL31菌株主要表現(xiàn)為3’端的核酸外切酶活性，同時(shí)伴有5’端外切及內(nèi)切酶活性上述活性嚴(yán)格依賴于Ca2的存在，可在反應(yīng)的不同階段通過(guò)加入螯合劑EGTA以終止反應(yīng)主要用途是可控制性地截短DNA分子2.外切核酸酶III(ExoIII)。從雙鏈DNA的3’OH

7、端逐一去除單核苷酸。對(duì)無(wú)Py、Pu位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶活性。3’磷酸酶活性：去除3’端磷酸基(3’P)。RNaseH活性。主要用途是通過(guò)其3’→5’的外切酶活性使雙鏈DNA分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)，ExoIII用于DNA標(biāo)記，ExoIII用于順序缺失3.λ外切核酸酶（λexo）.從單、雙鏈DNA的5’PO4基末端逐步切下5’PO4單核苷酸，不能降解5’OH端.主要用途是將雙鏈DNA變?yōu)閱捂?，供測(cè)序使用；除去5’端突起，產(chǎn)生3’端突起，便于加尾4.S

8、1核酸酶.特異性降解單鏈DNA和RNA，在最適條件下降解單鏈的速度比雙鏈快75000倍.最佳pH4.55.核糖核酸酶.RNaseA分離自牛胰臟，特異性降解RNA.對(duì)熱穩(wěn)定（100℃加熱15min仍具活性），抗去污劑.用于除去DNA樣品中的RNA分子6.RNaseH.降解DNARNA雜交分子中的RNA鏈.用于cDNA文庫(kù)建立時(shí)除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成7.脫氧核糖核酸酶I(DNaseI).內(nèi)切核酸酶，降解ss和dsDNA.當(dāng)

9、酶濃度很低時(shí)，dsDNA分子上將形成切口用途：.制備RNA樣品時(shí)除去DNA分子.切口移位，制備DNA探針1.大腸桿菌DNA聚合酶I(E.coliDNAPolI)E.coliDNAPolI的3種酶活性.5’→3’DNA聚合酶活性，要求3’OH的引物和模板DNA.5’→3’核酸外切酶活性，具有雙鏈特異性.3’→5’核酸外切酶活性，具有單鏈特異性，對(duì)dsDNA的降解活性很低，是ssDNA的過(guò)剩反應(yīng)用途：.除去3’端突起的單鏈DNA（在無(wú)dNT