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文檔簡介
1、第一節(jié) 微生物生理學(xué)研究對(duì)象和范圍,一、研究對(duì)象,微生物生理學(xué)(microbial physiology)的研究對(duì)象是微生物,它是微生物的一個(gè)重要分支,是從生理生化的角度研究微生物細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能、新陳代謝、生長繁殖等微生物生命活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科。,1. 19世紀(jì)70年代以后,隨著人們對(duì)釀酒、動(dòng)植物病害、人類疾病的防治和土壤微生物活動(dòng)等的研究,微生物生理學(xué)逐漸興盛起來。1905年,哈登和楊發(fā)現(xiàn)磷酸鹽對(duì)酒精發(fā)酵的作用;1911年,諾
2、伊貝格開始對(duì)酒精發(fā)酵作系統(tǒng)研究;20世紀(jì)30年代,生物化學(xué)的進(jìn)展又推動(dòng)了人們對(duì)微生物代謝的研究。2. 隨后,克勒伊沃和范尼爾等人從比較生物化學(xué)的角度,說明了某些微生物的相互關(guān)系和生理學(xué)問題。1933年,克勒伊沃建立了搖床培養(yǎng)技術(shù),導(dǎo)致現(xiàn)代化微生物工業(yè)深層培養(yǎng)的生理研究和應(yīng)用。3.同時(shí),同位素、電子顯微鏡、超速離心、微量快速生物化學(xué)分析以及生物化學(xué)突變株等技術(shù)的普遍應(yīng)用,也推動(dòng)了微生物生理學(xué)研究的發(fā)展。,二、微生物生理學(xué)的發(fā)展過程
3、,4.隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,微生物生理學(xué)的研究不斷地深入到,細(xì)胞中的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換;生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能;分子水平上的形態(tài)建成、分化及其行為等方面的研究方面。5.近年來,微生物生理學(xué)的研究擴(kuò)展到了新的或過去不引人注意的微生物類群和可更新能源方面,這使人們對(duì)分解纖維素微生物和甲烷產(chǎn)生菌的生理進(jìn)行深入的考察,并從化能自養(yǎng)菌的研究擴(kuò)展到利用硫桿菌進(jìn)行微生物浸礦。6.另外微生物與其他生物之間的共生、寄生關(guān)系是人們多年來
4、一直注意的領(lǐng)域,尤其是共生固氧的研究已有較大的進(jìn)展。能使石油氧化、農(nóng)藥降解和人工合成的高分子物質(zhì)分解的微生物,也越來越多地成為人們研究的對(duì)象??傊?,每一新菌屬和新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),都將為微生物生理學(xué)研究提供新的對(duì)象,開辟新的領(lǐng)域。,第二節(jié) 微生物生理學(xué)研究中常用的技術(shù)和方法,1.電子顯微鏡技術(shù) 6.層析技術(shù) 2.DNA分子鋪展技術(shù) 7.電泳技術(shù)3.超離心技術(shù) 8.電位、電勢、極譜技術(shù)4.光譜技術(shù)5.同位
5、素技術(shù),微生物生理學(xué)研究內(nèi)容:1.生物化學(xué)方面 研究微生物代謝、產(chǎn)物合成途徑、能量轉(zhuǎn)化等;研究一些特殊類型微生物的生理活動(dòng)。2.研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能 闡明微生物遺傳信息傳遞與表達(dá)的方式和規(guī)律,研究膜結(jié)構(gòu)和功能;極端環(huán)境條件下微生物抗性與敏感性的機(jī)理及其調(diào)節(jié)等。3.研究微生物細(xì)胞的重建、形態(tài)發(fā)生、分化過程與趨向性 研究運(yùn)動(dòng)的本質(zhì)、形態(tài)發(fā)生與分化的分子機(jī)理及有生物活性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過程。,第三章 微生物的營養(yǎng)與物質(zhì)運(yùn)
6、輸,第三節(jié) 營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié),一、營養(yǎng)物質(zhì)本身的性質(zhì) 細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)決定了不同的物質(zhì)透過膜的難易程度有差異,物質(zhì)的化學(xué)特性包括分子量、溶解性、電負(fù)性、極性等都影響營養(yǎng)物進(jìn)入細(xì)胞的難易程度。小分子>大分子、脂溶性>水溶性、不帶電荷>帶電荷物質(zhì),二、環(huán)境條件 1.溫度 2.pH 3.代謝和呼吸的抑制劑 4.通透性誘導(dǎo)物與被運(yùn)輸物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物。三、載體物質(zhì)生物合成調(diào)節(jié),在酶Ⅰ的作用下HPr被激
7、活,在酶Ⅱ的作用下P-HPr將磷酸轉(zhuǎn)移給糖,,,運(yùn)送機(jī)制:是依靠磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng),即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng).運(yùn)送步驟:1.熱穩(wěn)載體蛋白(HPr)的激活 細(xì)胞內(nèi)高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸基團(tuán)把HPr激活。 酶Ⅰ PEP+HPr 丙酮酸+P-HPrHPr是一種低分子量的可溶性蛋白,結(jié)合在細(xì)胞膜上,具有高能磷酸載體的作用。,,,2、糖被磷酸化后運(yùn)入
8、膜內(nèi) 膜外環(huán)境中的糖先與外膜表面的酶Ⅱ結(jié)合,再被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜表面。這時(shí),糖被P-HPr上的磷酸激活,并通過酶Ⅱ的作用將糖-磷酸釋放到細(xì)胞內(nèi)。 酶Ⅱ P-HPr+糖 糖-P +HPr 酶Ⅱ是一種結(jié)合于細(xì)胞膜上的蛋白,它對(duì)底物具有特異性選擇作用,因此細(xì)胞膜上可誘導(dǎo)出一系列與底物分子相應(yīng)的酶Ⅱ 。,,大腸桿菌己糖磷酸運(yùn)輸系統(tǒng)生物合成調(diào)節(jié)中有兩種蛋白在起作用:1.
9、存在于細(xì)胞質(zhì)中的活化蛋白A;2.位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)膜調(diào)節(jié)蛋白MR。,,,,,外 膜 內(nèi),外 膜 內(nèi),,,MR C A,MR C,,A,G-6-P,四、載體物質(zhì)生理活性調(diào)節(jié)1.膜電勢調(diào)節(jié)2.胞內(nèi)磷酸糖調(diào)節(jié)3.cAMP環(huán)化酶與滲透酶的共同調(diào)節(jié),,,,,,,,,PEP,Pyr,Ⅰ,Ⅰ,HPr,HPr,-Pi,-Pi,RPr,RPr,RPr,Pase,,Pase,-Pi,AC,,RPr,-Pi,AC,無活性,有活性,無活性,有活性,,,,
10、,,,,,,,乳糖滲透酶與腺苷酸環(huán)化酶的協(xié)調(diào)作用,第四節(jié) 代謝產(chǎn)物的分泌,一、氨基酸的分泌,表3-10 乳酸發(fā)酵短桿菌細(xì)胞內(nèi)磷脂含量與谷氨酸分泌的關(guān)系,谷氨酸發(fā)酵控制 生物素:作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶,參與脂肪酸的生物合成,進(jìn)而影響磷酯的合成。 當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí),細(xì)胞發(fā)生變形,谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出,積累于發(fā)酵液中。生物素過量,則發(fā)酵過程菌體大量繁殖,不產(chǎn)或少產(chǎn)
11、谷氨酸,代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。,,O,=,C,,,HN,NH,,,HC,CH,,,,H2C,C,S,,,,H,,,,,,(CH2)4,C,NH,,,BCCP賴氨酸殘基,生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein BCCP),生物素,O,=,H,OH,+,,H2O,,ATP,,ADP,CO2,,生物素羧化酶,-,酶,BCCP-羧基生物素,BCCP-羧基生物素在轉(zhuǎn)羧酶作用下,形成丙二酰Co
12、A丙二酰CoA與乙酰CoA縮合并脫羧,生成丁酰CoA,如此反復(fù)進(jìn)行合成高級(jí)脂肪酸,再合成磷脂生物素不足時(shí),就抑制了不飽和脂肪酸的生成,從而影響了磷脂的生成,導(dǎo)致磷脂含量不足,使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完全,從而提高細(xì)胞膜的通透性,怎樣克服生物素過量帶來的問題,為了控制生物素的數(shù)量,除了選用的菌種必須是生物素缺陷型以外,所用的原料(主要是玉米漿)每批都要通過搖床實(shí)測后確定加入量。當(dāng)前還有一些措施可以使用。,A、 選用油酸缺陷型:
13、 在大量的研究工作中,發(fā)現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象,即培養(yǎng)基中缺乏生物素時(shí),只要加入油酸,就能起到和生物素相同的效果。 如上所述,生物素的作用在于影響細(xì)胞膜中的脂肪酸,而油酸的加入直接增加了合成磷脂所需的不飽和脂肪酸,所以選育油酸缺陷型就成為了重要的替代手段。當(dāng)選用油酸缺陷型時(shí),只要控制油酸的亞適量,就能控制細(xì)胞膜的透性,而與生物素的含量無關(guān)。,B 、選用甘油缺陷型: 試驗(yàn)證明,限量甘油(0.02%)培養(yǎng),細(xì)
14、胞膜的磷脂含量只有非甘油缺陷型菌株的50%。只有甘油的加入量起作用,而與生物素以及油酸的含量無關(guān)。 這些現(xiàn)象都可以解釋一個(gè)問題,那就是因?yàn)榱字怯芍舅帷⒏视?、磷酸和R(膽堿、乙醇酸、絲氨酸、肌醇)4部分組成,缺少其中的一個(gè)都不可能和成,控制其中之一,都可以控制磷脂的含量。 圖6-4,C、溫度敏感性變異株: 當(dāng)細(xì)菌進(jìn)行誘變處理后,可以獲得溫度敏感性變異株。例如在30゜C時(shí)生長旺盛,而在較高溫
15、度(37゜C )則不生長,或稍生長,而能大量生成谷氨酸。于是可用這樣的變異株在富含生物素的培養(yǎng)基中,前期進(jìn)行30゜C培養(yǎng),當(dāng)菌的生長達(dá)到最大時(shí),提高溫度至40゜C ,使其大量積累谷氨酸。,D、 在生物素豐富的條件下,添加聚氧乙烯乙二醇的棕櫚酸(C18)、十七烷酸(C17)、硬脂酸(C16)等的飽和脂肪酸酯類或飽和脂肪酸,都能使大量谷氨酸排出于菌體外。 表面活性劑、高級(jí)飽和脂肪酸的作用,不在于它的表面效果,而是在不飽和
16、脂肪酸的合成過程中,作為抗代謝物具有抑制作用,對(duì)生物素或油酸又拮抗作用,阻遏脂肪酸生物合成,于是磷脂形成減少,膜透性加大,有利于谷氨酸向外滲漏。,E、在生物素豐富時(shí),培養(yǎng)中途如果添加青霉素、頭孢霉素C,可以使谷氨酸生成。青霉素的作用機(jī)制與控制生物素、控制油酸或添加表面活性劑以及控制甘油的機(jī)制都不同。 添加青霉素是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的后期合成,對(duì)細(xì)胞壁糖肽生物合成系統(tǒng)起作用。這是因?yàn)榍嗝顾厝〈铣商请牡牡孜锒兔傅幕钚?/p>
17、中心結(jié)合,使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連接不起來,結(jié)果形成不完全的細(xì)胞壁。沒有細(xì)胞壁保護(hù)的細(xì)胞膜由于膜內(nèi)外的滲透壓差,是細(xì)胞膜受到機(jī)械損傷,失去了作為滲透障礙物的作用,從而使谷氨酸排出。另一種解釋是:青霉素雖不能抑制磷脂的合成,但能造成磷脂向胞外分泌。表6-5,CH2OH,,,,O,,,,,,,,,CH2OH,,,O,,,,,,,,O,,,,O,,CH3-CH-C=O,NH,,,,,,,,,,,,C,CH3,H,C=O,NH,C,H,-OOC,,,(CH
18、2)2,C=O,C=O,NH,C,(CH2)4,H,,,,OH,,NH,C,=,O,CH3,NH,C,=,O,CH3,,,,,,,,L-Ala,D-Glu,,NH3+,NH,C,CH3,H,C=O,,,L-Lys,D-Ala,,,,,,,,,,,,,,(Gly)5,NAM,NAG,肽聚糖結(jié)構(gòu),,N,,H,二、核苷酸的分泌 核苷酸不容易分泌到細(xì)胞外。Mn2+對(duì)產(chǎn)氨短桿菌核苷酸分泌起關(guān)鍵作用。 Mn2+可引起細(xì)胞形態(tài)變化,在肌苷-磷酸
19、(IMP)發(fā)酵中,控制Mn2+限量,造成細(xì)胞膨脹,呈不規(guī)則型,膜產(chǎn)生異常,膜通透性被破壞,IMP、Hx和R-5-P都分泌于體外;當(dāng)Mn2+過量時(shí),菌體呈小球狀,抑制這些物質(zhì)的分泌。,三、胞外酶的分泌,第四章 異養(yǎng)微生物的生物氧化,第五章 自養(yǎng)微生物的生物氧化,第六章 微生物的合成代謝,一、微生物代謝過程中的自我調(diào)節(jié),☆微生物代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)的特點(diǎn):精確、可塑性強(qiáng),細(xì)胞水平的代謝調(diào)節(jié)能力超過高等生物。成因:細(xì)胞體積小,所處環(huán)境多變。
20、舉例:大腸桿菌細(xì)胞中存在2500種蛋白質(zhì),其中上千種是催化正常新陳代謝的酶。每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的體積只能容納10萬個(gè)蛋白質(zhì)分子,所以每種酶平均分配不到100個(gè)分子。如何解決合成與使用效率的經(jīng)濟(jì)關(guān)系?解決方式:組成酶(constitutive enzyme)經(jīng)常以高濃度存在,其它酶都是誘導(dǎo)酶(inducible enzyme),在底物或其類似物存在時(shí)才合成,誘導(dǎo)酶的總量占細(xì)胞總蛋白含量的10%。,第七章 微生物代謝調(diào)節(jié),,Plac,工業(yè)
21、發(fā)酵的目的:大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制:人為地打破微生物的代謝控制體系,使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。人工控制代謝的手段: 改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法); 控制發(fā)酵條件(生物化學(xué)方法); 改變細(xì)胞膜透性;,第一節(jié) 代謝調(diào)節(jié)的部位,一、控制營養(yǎng)物質(zhì)透過
22、細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞二、通過酶的定位控制酶與底物的接觸三、控制代謝物流向:,一、細(xì)胞(及細(xì)胞器)膜,1)細(xì)胞膜既是溶質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的主要屏障,有是養(yǎng)分吸收和分泌的通道。通過對(duì)透性酶本身的合成控制以及ATP的供應(yīng),可以調(diào)節(jié)基質(zhì)的輸入。中間產(chǎn)物的透性,可以通過控制環(huán)境條因素,影響膜雙分子層中的磷脂和細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖的形成來調(diào)節(jié)。2)真核微生物膜密切相關(guān)的調(diào)節(jié)有:環(huán)境條件對(duì)膜脂理化性質(zhì)的影響; 膜蛋白質(zhì)的絕對(duì)數(shù)量及其活性的調(diào)節(jié);跨膜的電化
23、學(xué)梯度以及ATP、ADP、AMP體系及無機(jī)磷濃度對(duì)溶質(zhì)輸送的調(diào)節(jié)。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的部分破壞或變形,間接影響到膜對(duì)溶質(zhì)的通透性。,1.控制營養(yǎng)物質(zhì)透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞 如:只有當(dāng)速效碳源或氮源耗盡時(shí),微生物才合成遲效碳源或氮源的運(yùn)輸系統(tǒng)與分解該物質(zhì)的酶系統(tǒng)。,二、酶本身,1.調(diào)節(jié)酶的生成量 基因水平調(diào)節(jié)2.調(diào)節(jié)酶的活性 分子水平調(diào)節(jié),1)可逆反應(yīng)途徑由同種酶催化,可由不同輔基或輔酶控制代謝物流向:如:
24、兩種Glu脫氫酶:以NADP為輔基 Glu合成 以NAD為輔基 Glu分解 2)通過調(diào)節(jié)酶的活性或酶的合成量。關(guān)鍵酶: 某一代謝途徑中的第一個(gè)酶或分支點(diǎn)后的第一個(gè)酶。 ①粗調(diào):調(diào)節(jié)酶的合成量②細(xì)調(diào):調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶分子的活性
25、 3)通過調(diào)節(jié)產(chǎn)能代謝速率。,控制代謝物流向:( 通過酶促反應(yīng)速度來調(diào)節(jié)),三、酶與底物的相對(duì)位置及間隔狀況,1)真核微生物酶定位在相應(yīng)細(xì)胞器上;細(xì)胞器各自行使某種特異的功能; 2)原核微生物在細(xì)胞內(nèi)劃分區(qū)域集中某類酶行使功能: 與呼吸產(chǎn)能代謝有關(guān)的酶位于膜上; 蛋白質(zhì)合成酶和移位酶位于核糖體上; 同核苷酸吸收有關(guān)的酶在G-菌的周質(zhì)區(qū)。,第二節(jié) 酶活性的調(diào)節(jié),通過改變現(xiàn)成的酶分子活性來調(diào)節(jié)新陳代謝的速率的方式。是酶分子
26、水平上的調(diào)節(jié),屬于精細(xì)的調(diào)節(jié)。(一)調(diào)節(jié)方式:包括兩個(gè)方面:1、酶活性的激活:在代謝途徑中后面的反應(yīng)可被較前面的反應(yīng)產(chǎn)物所促進(jìn)的現(xiàn)象;常見于分解代謝途徑。 如:粗糙脈孢霉的異檸檬酸脫氫酶的活性受檸檬酸促進(jìn)2、酶活性的抑制:包括:競爭性抑制和反饋抑制。反饋:指反應(yīng)鏈中某些中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物對(duì)該途徑關(guān)鍵酶活性的影響。 凡使反應(yīng)速度加快的稱正反饋; 凡使反應(yīng)速度減慢的稱負(fù)反饋(反饋
27、抑制); 反饋抑制——主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時(shí)可反過來直接抑制該途徑中第一個(gè)酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸合成途徑中。特點(diǎn):作用直接、效果快速、末端產(chǎn)物濃度降低時(shí)又可解除,如:天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶受ATP激活,受CTP抑制(終產(chǎn)物)。 大腸桿菌糖代謝過程中,許多酶都有激活劑和抑制劑(表3-1)。共同控制糖代謝。,,,二、酶活性調(diào)節(jié)的方式,1.終產(chǎn)物抑制與激活2.底物水平的抑制與激活3.輔助因子的
28、調(diào)節(jié)4.酶原的激活5.潛在酶的激活,1.無分支途徑的調(diào)節(jié)方式,(1)前饋?zhàn)饔茫╢eedforword)指的是在代謝途徑中前面的底物對(duì)其后某一催化反應(yīng)的酶又作用。該作用可以是對(duì)酶活性的抑制或激活。(2)終產(chǎn)物抑制 反饋抑制——主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時(shí)可反過來直接抑制該途徑中第一個(gè)酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸合成途徑中。(3)補(bǔ)償性激活 分支代謝途徑中,當(dāng)某一終產(chǎn)物的合成需要兩種前體時(shí),另一前體物的大量存在可能激
29、活受終產(chǎn)物抑制的酶的活性。,1.協(xié)同反饋抑制——concerted feedback inhibition,定義:分支代謝途徑中幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。舉例:谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa) 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制和阻遏。,二、分支代謝途徑的調(diào)節(jié)方
30、式,天冬氨酸 E,R 4-磷酸天冬氨酸E天冬氨酸半醛E,R E二氫吡啶二羧酸 同型絲氨酸同型絲氨酸磷酸E,R R O-琥珀酰同型絲氨酸 蘇氨酸 E,R六氫吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸 R 二氨基庚二酸
31、同型半胱氨酸 R 賴氨酸 甲硫氨酸 異亮氨酸,天冬氨酸族(谷氨酸棒桿菌),2.積累反饋抑制——cumulative feedback inhibition,定義:每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨(dú)抑制共同途徑中前面的酶,所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時(shí)它們的抑制作用是積累的,各末端產(chǎn)物之間既無協(xié)同效應(yīng),亦無拮抗作用。,3.合作反饋抑制——cooperative feedback i
32、nhibition,定義:兩種末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí),共同的反饋抑制作用大于二者單獨(dú)作用之和。舉例:在嘌呤核苷酸合成中,磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP (和IMP)的合作反饋抑制,二者共同存在時(shí),可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨(dú)過量時(shí),分別抑制其活性的70%和10%。,(5)順序反饋抑制——sequential feedback inhibition,一種終產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致前一中間產(chǎn)物的積累,通過后者反饋抑制合成途徑關(guān)鍵酶的活性,
33、使合成終止。舉例:枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調(diào)節(jié),5.同功酶調(diào)節(jié)——isoenzyme,定義:催化相同的生化反應(yīng),而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義:在一個(gè)分支代謝途徑中,如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶催化時(shí),則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對(duì)這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用?!骋划a(chǎn)物過量僅抑制相應(yīng)酶活,對(duì)其他產(chǎn)物沒影響。舉例:大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié),天冬氨酸族,天冬氨酸E,R III
34、 IE,R4-磷酸天冬氨酸E天冬氨酸半醛E,R II I E二氫吡啶二羧酸 同型絲氨酸同型絲氨酸磷酸E,R R O-琥珀酰同型絲氨酸 蘇氨酸 E,R六氫吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸 R
35、 二氨基庚二酸同型半胱氨酸 R 賴氨酸 甲硫氨酸 異亮氨酸,,(1)平衡合成,在黃色短桿菌(Brevibacterium flavus)中天冬氨酸的合成PEP Py草酰乙酸乙酰CoAAsp 檸檬酸ATPCO2,3.代謝途徑的橫向調(diào)節(jié),(2)代謝互鎖,表面完全不相關(guān)的兩條途徑之間的調(diào)節(jié)。這種作用一般在高濃度下才顯示,
36、且為部分抑制。AspAsp- pAsaDAPLys,二氫吡啶二羧酸合成酶HseThr IlePy 異丙基Leu 蘋果酸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(三)酶活力調(diào)節(jié)的機(jī)制,變構(gòu)酶理論: 變構(gòu)酶為一種變構(gòu)蛋白,酶分子空間構(gòu)象的變化 影響酶活。其上具有兩個(gè)以上立體專一性不同的接受部位,一個(gè)是活性
37、中心,另一個(gè)是調(diào)節(jié)中心。,活性位點(diǎn):與底物結(jié)合變構(gòu)位點(diǎn):,與抑制劑結(jié)合,構(gòu)象變化,不能與底物結(jié)合 與激活劑結(jié)合, 構(gòu)象變化,促進(jìn)與底物結(jié)合,,變構(gòu)酶,根據(jù)變構(gòu)酶蛋白的作用,可以把它們分為兩類: (1)非酶變構(gòu)蛋白酶 主要包括調(diào)節(jié)蛋白和受控載體蛋白。調(diào)節(jié)蛋白即由調(diào)節(jié)基因編碼的在操縱子表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用的蛋白,其本身沒有催化活性,但是它們可以控制相應(yīng)的酶的活性,或影響酶與蛋白質(zhì)的合成。 有些載體蛋白也是變構(gòu)蛋白,如乳糖透性酶。(
38、2)變構(gòu)酶,2.共價(jià)修飾調(diào)節(jié)理論,(1)可逆性共價(jià)修飾(2)不可逆共價(jià)修飾,3.其他調(diào)節(jié)方式(1)締合與解離(2)競爭性抑制,第二節(jié) 酶合成的調(diào)節(jié),通過調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機(jī)制,是基因水平上的調(diào)節(jié),屬于粗放的調(diào)節(jié),間接而緩慢。(一)酶合成調(diào)節(jié)的類型1.誘導(dǎo)(induction):是酶促分解底物或產(chǎn)物誘使微生物細(xì)胞合成分解代謝途徑中有關(guān)酶的過程。微生物通過誘導(dǎo)作用而產(chǎn)生的酶稱為誘導(dǎo)酶(為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類
39、似物而臨時(shí)合成的酶類)。 舉例:E.coli在含乳糖的培養(yǎng)基中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷滲透酶等。 誘導(dǎo)物(inducer):底物或結(jié)構(gòu)類似物,如:異丙基- β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,isopropylthiogalactoside)。 ★誘導(dǎo)作用的類型:同時(shí)誘導(dǎo):誘導(dǎo)物加入后,微生物能同時(shí)誘導(dǎo)出幾種酶的合成,主要存在于短的代謝途徑中。 順序誘導(dǎo):先合成能分解底物的酶,再合成分解各中間代謝物的
40、酶達(dá)到對(duì)復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。,組成酶(固有酶):不依賴底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如:EMP途徑的一些酶。誘導(dǎo)酶:依賴于底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如:乳糖酶。,(一)酶合成調(diào)節(jié)的類型-2,2.阻遏(repression):,,是阻礙代謝過程中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成的現(xiàn)象,從而更徹底地控制和減少末端產(chǎn)物的合成?!镒瓒糇饔玫念愋停孩倌┒水a(chǎn)物阻遏(end-product repression):由于終產(chǎn)
41、物的過量積累而導(dǎo)致生物合成途徑中酶合成的阻遏的現(xiàn)象,常常發(fā)生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等這些重要結(jié)構(gòu)元件生物合成的時(shí)候。例如過量的精氨酸阻遏了參與合成精氨酸的許多酶的合成。,②分解代謝物阻遏(catabolite repression): 當(dāng)微生物在含有兩種能夠分解底物的培養(yǎng)基中生長時(shí),利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶的合成的現(xiàn)象。最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌生長在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基時(shí),故又稱葡萄糖效應(yīng)。分解代謝物阻遏導(dǎo)致出現(xiàn)“
42、二次生長(diauxic growth)”. 直接作用者是優(yōu)先利用的碳源的中間代謝物——實(shí)質(zhì)是:因代 謝反應(yīng)鏈中某些中間代謝物或末端代謝物的過量積累而阻遏代謝中一些酶的合成的現(xiàn)象。,2.分解代謝物的阻遏Catabolite Repression :,1)二次生長現(xiàn)象及其機(jī)制: 分解葡萄糖的酶—— 組成酶(固有酶) 分解乳糖的酶——誘導(dǎo)酶, 受葡萄糖分解代謝產(chǎn)物的 調(diào)控。,Figure 9. The Diau
43、xic Growth Curve of E. coli grown in limiting concentrations of a mixture of glucose and lactose,3.酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制,操縱子學(xué)說概述:1、操縱子(operon):是基因表達(dá)和控制的一個(gè)完整單元,其中包括結(jié)構(gòu)基因,調(diào)節(jié)基因,操作子和啟動(dòng)子。①結(jié)構(gòu)基因(structural genes):是決定某一多肽的DNA 模板,可根據(jù)其上的堿基順序轉(zhuǎn)
44、錄出相應(yīng)的mRNA,然后再可通過核糖體轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的酶;(編碼蛋白質(zhì)的DNA序列) ②啟動(dòng)子(promoter):能被依賴于DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的堿基順序,是RNA聚合酶的結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn);(在許多情況下還包括促進(jìn)這一過程的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。)③操縱子(operator):位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序,是阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn),能通過與阻遏物相結(jié)合來決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄是否能進(jìn)行; ④調(diào)節(jié)基因(regulator ge
45、ne):用于編碼組成型調(diào)節(jié)蛋白的基因,一般遠(yuǎn)離操縱子,但在原核生物中,可以位于操縱子旁邊,編碼調(diào)節(jié)蛋白。,,Structure of a typical operon,3、阻遏物(repressor)與阻遏物蛋白(aporepresseor)——二者都是由調(diào)節(jié)基因編碼產(chǎn)生特異性調(diào)節(jié)蛋白(regulatory potein) ;它倆是一類低分子量變構(gòu)蛋白,有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),一個(gè)與操縱基因結(jié)合,另一位點(diǎn)可與效應(yīng)物結(jié)合;當(dāng)調(diào)節(jié)蛋白與效應(yīng)物結(jié)合后
46、,就發(fā)生變構(gòu)作用,變構(gòu)后與操縱基因的結(jié)合能力可提高或下降。(有活性——可與O結(jié)合;無活性——不與O結(jié)合)阻遏物:能在沒有誘導(dǎo)物時(shí)與操縱基因結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白;阻遏物蛋白:只能在有輔阻遏物存在時(shí)才能與操縱基因結(jié)合。,三、酶的誘導(dǎo)和阻遏的調(diào)節(jié)方式,1.單個(gè)終產(chǎn)物的生物合成途徑(1)簡單終產(chǎn)物阻遏(2)可被阻遏的酶的產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用,2.多個(gè)終產(chǎn)物的生物合成途徑(1)多個(gè)單功能酶的簡單終產(chǎn)物阻遏(2)多功能酶的多價(jià)阻遏 (3)催化兩條
47、不同途徑的共用酶系阻遏,3.分解代謝途徑(1)分解代謝物阻遏(2)起始底物的誘導(dǎo)作用(3)降解代謝途徑的中間產(chǎn)物所引起的誘導(dǎo)作用(4)匯流降解代謝途徑(5)多功能途徑的誘導(dǎo),四、酶合成調(diào)節(jié)的分子機(jī)制,1.誘導(dǎo)作用的分子機(jī)制(1)正調(diào)控和負(fù)調(diào)控(2)協(xié)同誘導(dǎo)和順序誘導(dǎo)2.分解代謝物阻遏的分子機(jī)制3.末端代謝產(chǎn)物阻遏的分子機(jī)制和弱化調(diào)節(jié)機(jī)制,1.終產(chǎn)物的阻遏:(end product repression):( 反饋?zhàn)瓒?
48、 即在合成代謝中,終產(chǎn)物阻遏該途徑 所有酶的合成。為基因表達(dá)的控制 。 如:色氨酸(Try)合成的調(diào)控(正調(diào)節(jié)),Figure 5. Genetic organization of the Trp operon and its control elements,,The Tryptophan Operon,細(xì)菌的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,五、反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舻谋容^,能荷(Energy charge): 三磷酸腺苷(ATP)是為許多反應(yīng)提供能
49、量的高能磷酸化物 ,細(xì)胞中的ATP、ADP和AMP含量處于相對(duì)平衡的狀態(tài)——細(xì)胞中的能量狀態(tài),能荷(Energy charge)來表示細(xì)胞中的能量狀態(tài)。能荷(EC)可用下式來表示:,,系統(tǒng)中只有ATP時(shí),EC值為1;只有AMP時(shí),EC值等于0。,一、產(chǎn)能代謝的調(diào)節(jié):能荷調(diào)節(jié),第四節(jié) 代謝調(diào)控,概念:有氧條件下,發(fā)酵作用受抑制的現(xiàn)象(或氧對(duì)發(fā)酵的抑制現(xiàn)象)。意義:合理利用能源,通風(fēng)對(duì)酵母代謝的影響,巴斯德效應(yīng)(The Paste
50、ur effect ),現(xiàn)象:,巴斯德效應(yīng)(Pasteur effect)機(jī)理,巴斯德在研究酵母的酒精發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn):厭氧條件下酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵,葡萄糖的消耗速度很快;而在有氧條件下,酵母菌進(jìn)行呼吸作用,糖的消耗速度較低,酒精產(chǎn)量也降低。,呼吸抑制發(fā)酵作用的的現(xiàn)象,,巴斯德效應(yīng)的本質(zhì)是能荷調(diào)節(jié)。,,能荷不僅能調(diào)節(jié)分解代謝形成ATP的酶活性,也能調(diào)節(jié)合成代謝利用ATP的酶活性。,細(xì)胞能荷可調(diào)節(jié)酶活性,高能荷的抑制高能荷的抑制異檸檬酸脫氫酶和
51、磷酸果糖激酶等,檸檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制劑,從而限制了葡萄糖的利用速度。,有氧條件下,大量合成ATP,細(xì)胞能荷增加,異檸檬酸脫氫酶受到ATP抑制,導(dǎo)致檸檬酸的積累,,,,在厭氧條件下,酵母菌無法通過呼吸鏈產(chǎn)生ATP,細(xì)胞能荷較低。,ADP和AMP激活磷酸果糖激酶,使利用葡萄糖生產(chǎn)酒精的速度加快。,,,通氧,[ATP],[檸檬酸],能荷,,異檸檬酸脫氫酶活性,,,,,,,,,,,,,,,磷酸果糖激酶活性,,[6—磷酸葡萄糖
52、],,基團(tuán)移位吸收葡萄糖速率,,,,,,,,,,,,,,,,,二、細(xì)胞滲透性調(diào)控,提高細(xì)胞滲透性的主要方法:1.限制培養(yǎng)基中生物素濃度在1-5mg/L,可以控制細(xì)胞膜中脂質(zhì)的合成,從而控制代謝物產(chǎn)量。2.通過誘變育種的方法,篩選細(xì)胞透性突變株,如工程構(gòu)建和篩選生產(chǎn)菌株的生物素缺陷型、油酸、甘油缺陷型。3.添加表面活性劑或脂溶劑如棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、土溫80等表面活性劑。4.添加青霉素。5.控制Mn2+、Zn2+的濃度,干
53、擾細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的形成。,分支途徑——①賴氨酸發(fā)酵:谷氨酸棒桿菌的Hom–,1、應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株解除正常的反饋調(diào)節(jié),三、菌種遺傳特性的改變,分支途徑——②肌苷酸發(fā)酵 (IMP合成途徑的代謝調(diào)控),1.2 抗反饋控制突變株的應(yīng)用,★抗反饋控制突變株——是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?,或兩者兼有之的菌株?!锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和營養(yǎng)缺陷性回復(fù)突變株中獲得?!铽@得方法及其原理:,1.3選育組
54、成型突變株和超產(chǎn)突變株,如果調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變,以至產(chǎn)生無效的阻遏物而不能和操縱基因結(jié)合,或操縱基因突變,從而造成結(jié)構(gòu)基因不受控制的轉(zhuǎn)錄,酶的生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏,這樣的突變株稱為 組成型突變株。少數(shù)情況下,組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親本高的多的酶,這種突變株稱為超產(chǎn)突變株。,4.抗性突變株的應(yīng)用(1)抗生素抗性突變。(2)抗噬菌體菌株的選育。(3)條件抗性突變(4)敏感突變5.增加結(jié)構(gòu)基因數(shù)目
55、 增加發(fā)酵產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)基因數(shù)目可以提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。,四、發(fā)酵工藝條件的控制,1.控制培養(yǎng)基成分2.控制發(fā)酵條件,★當(dāng)發(fā)酵液處在堿性條件下,酵母的乙醇發(fā)酵會(huì)改為甘油發(fā)酵。原因:該條件下產(chǎn)生的乙醛不能作為正常受氫體,結(jié)果2分子乙醛間發(fā)生歧化反應(yīng),生成1分子乙醇和1分子乙酸;,CH3CHO+H2O+NAD+ CH3COOH+NADH+H+CH3CHO+NADH+H+
56、CH3CH2OH+ NAD+ 此時(shí)也由磷酸二羥丙酮擔(dān)任受氫體接受3-磷酸甘油醛脫下的氫而生成 ?-磷酸甘油,后者經(jīng)?-磷酸甘油酯酶催化,生成甘油。,,,,,,,,,2葡萄糖 2甘油+乙醇+乙酸+2CO2,,DA B C
57、 E F,(二)生物化學(xué)方法,1. 添加前體繞過反饋控制點(diǎn):亦能使某種代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生,(-),(-),(-),2. 添加誘導(dǎo)劑:從提高誘導(dǎo)酶合成量來說,最好的誘導(dǎo)劑往往不是該酶的底物,而是底物的衍生物,3. 發(fā)酵與分離過程耦合:4. 控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分:,第八章 微生物的次級(jí)代謝及其調(diào)節(jié),次生代謝物(secondary metabolite):指某些微生物生長到穩(wěn)定期前后,以結(jié)構(gòu)簡單、代謝途徑明確
58、、產(chǎn)量較大的初生代謝物為前體,通過復(fù)雜的次生代謝途徑所合成的各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。種類:抗生素、色素、毒素、生物堿、信息素(pheromone),生長促進(jìn)劑、 生物藥物素。,二、Gaden對(duì)發(fā)酵的三分類與Pirt方程:,〖一類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長相偶聯(lián),,,,,x,p,X,P,時(shí)間,X或者P,1.生長偶聯(lián)型,dP/dt=αdX/dtπ=αµP----- 產(chǎn)物濃度α---系數(shù)π---產(chǎn)物形成
59、比率π=dP/dt/X,〖二類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián),,,,,x,p,時(shí)間,X或者P,X,P,2.混合生長偶聯(lián)型,dP/dt=αdX/dt+βXπ=αµ+β如:PHB的生產(chǎn)包括了非產(chǎn)物生物量和產(chǎn)物生物量dX/dt=dR/dt+dP/dtdR/dt=µmaxR[N/(Ks+N)],〖三類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長非偶聯(lián)偶聯(lián),,,x,p,,,3.非生長偶聯(lián)型,時(shí)間,X或者P,X,P,dP/
60、dt=βXπ=β,〖Pirt方程〗,π=α μ + β,α =0、 β ≠0: 可表示一類發(fā)酵,α ≠0、 β =0: 可表示二類發(fā)酵,α ≠0、 β ≠0:可表示三類發(fā)酵,第一節(jié) 次級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物,一、次級(jí)代謝產(chǎn)物類型1.根據(jù)產(chǎn)物的作用分類 (1)抗生素 (2)激素 (3)維生素 (4)毒素 (5)生物堿 (6)色素,2.根據(jù)產(chǎn)物的主要成分及其與初級(jí)代謝的關(guān)系分類 (1)糖類 (2)多肽類 (3)聚酯酰類
61、 (4)核酸堿基類似物 (5)其他類型 (6)色素,二、次級(jí)代謝的特點(diǎn) 1.次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與微生物的生長不呈平行關(guān)系,〖三類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長非偶聯(lián)偶聯(lián),,,x,p,,,非生長偶聯(lián)型,時(shí)間,X或者P,X,P,dP/dt=βXπ=β,2.次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體,并受初級(jí)代謝的調(diào)節(jié),CO2,HMP途徑,,,,,糖類,,EMP途徑,,乙酰乙酰CoA 甲羥戊酸
62、 異戊 二萜:赤霉素類 二烯酸 倍半萜:隱杯傘類,,,,,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰-CoA,,,,,,乙酰-CoA,赤蘚糖-4-P,,莽草酸,,,,,氯霉素,,芳香族氨基酸脂肪族氨基酸,,TCA循環(huán),,,,丙二酰 聚酮酐CoA,大環(huán)內(nèi)酯類
63、抗生素四環(huán)素類灰黃霉素黃曲霉毒素,,,,多肽類類抗生素β-內(nèi)酰胺類抗生素氨基酸衍生物類,,,,,,,CO2,,3.次級(jí)代謝酶系對(duì)底物要求的專一性不強(qiáng) 多代謝作用;產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生至少10個(gè)不同特性的青霉素,其中青霉素G的活性最高。桿菌肽族有10種,黃曲霉毒素族有8種,某種小單胞菌產(chǎn)生的氨基環(huán)多醇類抗生素竟多達(dá)48種。4.次級(jí)代謝產(chǎn)物種類繁多、結(jié)構(gòu)特殊5.次級(jí)代謝酶在細(xì)胞中具有特定的位置和結(jié)構(gòu),6.次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成過程由
64、多基因控制7.次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成對(duì)環(huán)境因素特別敏感8.菌種與次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)之間沒有明確的分類學(xué)上的內(nèi)在聯(lián)系。9.次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與菌體的形態(tài)變化有一定的關(guān)聯(lián)。,三、次級(jí)代謝的生理功能 1.受支持的觀點(diǎn) (1)進(jìn)化遺留所致 (2)在自然界具有生態(tài)上的功能 (3)與細(xì)胞分化有關(guān) (4)代謝維持產(chǎn)物,1.被駁斥的觀點(diǎn) (1)支路代謝物 (2)次級(jí)代謝產(chǎn)物是儲(chǔ)藏物質(zhì)的一種形式 (3)解除體內(nèi)有害代謝物的毒性 (
65、4)競爭需要,由于抵抗惡劣環(huán)境、抑制其他微生物、爭奪有限的養(yǎng)分。 (5)作為正常代謝的無用副產(chǎn)物 (6)大分子消化后殘留的碎片,一、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生源 1.聚酮體 2.甲羥戊酸 3.糖類和氨基糖 4.不常見的氨基酸 5.環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇 6.非核酸的嘌呤堿和嘧啶堿的生物合成,第二節(jié) 次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成,7.吩噁嗪酮 8.莽草酸 二、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的基本過程 谷氨酰胺 酪氨酸 莽
66、草酸 新生霉素,1.產(chǎn)物的全部或部分由初級(jí)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化而成(1)與氨基酸代謝有關(guān)的生物合成途徑 (2)與核苷酸代謝有關(guān)的生物合成途徑,(3)與輔酶代謝有關(guān)的生物合成途徑 2.產(chǎn)物由單一前體聚合而成 (1)聚酮類化合物的生物合成,(2)多肽類化合物的生物合成 a.氨基酸活化生成磷酸酯; b.大分子聚肽鏈通過蛋白質(zhì)合成的常規(guī)途徑經(jīng)轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)合成。 c.經(jīng)多酶復(fù)合物將氨基酸活化后按
67、硫模板機(jī)理縮合,形成肽鏈。①通過硫模板機(jī)理生物合成的多肽類化合物②通過核糖體介導(dǎo)的多肽類化合物的生物合成(3)類異戊二烯類化合物的生物合成,3.產(chǎn)物由中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾而成,4.產(chǎn)物由不同前體裝配而成,第三節(jié) 次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成,一、初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié) 二、碳代謝物的調(diào)節(jié) 三、氮代謝物的調(diào)節(jié) ppGpp調(diào)控:當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺乏氨基酸時(shí)做出的應(yīng)急反應(yīng),產(chǎn)生ppGpp,可在很大范圍內(nèi)做出如抑制核糖體和其他大分子合成等應(yīng)急反
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