分子植物病理學緒論剖析-(378)

1、分子植物病理學 (導論）Molecular Plant Pathology（introduction）,課程性質(zhì)與教學目的,分子植物病理學是植物保護專業(yè)的專業(yè)選修課。教學目的是使學生了解植物病理學的前沿問題和相應的研究技術，加強本學科與其它學科的融合，會用新的思維來理解病理學問題，用先進的實驗手段來解決植物病理學問題，并對其它專業(yè)技能具有好的輔助提高的作用,分子植物病理學在病理學中的地位,植物病理學： 從群體-個體-

2、組織-細胞-分子水平不斷發(fā)展分子植物病理學是應用基礎科學分子植物病理學是交叉學科。是遺傳學、現(xiàn)代物理學、生物化學、分子生物學和植物病理學的交叉滲透。學科交叉更促進了其發(fā)展。,,緒　論,1、概念（conception）　　分子植物病理學是在分子水平上研究并解釋植物病理現(xiàn)象、討論和解決植物病害防治理論及其途徑的科學。 是指應用分子生物學理論和DNA重組技術，研究病害發(fā)生機制，闡明病程中寄主-病原物相互作用的分子基礎

3、，寄主、病原物與病程相關的基因及其結(jié)構、表達和調(diào)控。,植物病理學的發(fā)展緊跟生物科學的發(fā)展，從認識病害開始，經(jīng)歷了癥狀學(Symptomatology) 、病原學(plant aetiology) 、寄主和病原物相互作用的遺傳學( genetics of the interaction between host and pathogen) 、病理生理和生化(Pathological Physiology and Biochemistry)

4、，直至進入了分子病理學階段。從而把病害的表型與病原和寄主的基因及表達聯(lián)系起來。,2. 研究內(nèi)容(contents),應用分子生物學理論和DNA重組技術，研究植物病害的發(fā)生機制，闡明病程中，寄主－病原物相互作用的分子基礎；寄主、病原物與病程相關的基因及其結(jié)構、表達和調(diào)控機制。 主要研究對象核酸(nucleic acid)和蛋白(protein)等生物大分子，也包括多糖(polysaccharide)、酚類化合物(hyd

5、roxybenzene)和有機酸(organic acid )等以及一些小分子次生代謝物(secondary metabolites)。,,從識別（identification）、信息傳遞（information transduction）和病害表型(disease phenotype) 三個方面闡述寄主-病原物互作的分子內(nèi)涵。（1）識別是二者表面大分子決定的，識別的結(jié)果決定寄主和病原互作的親和性。（2）信息傳遞是二者互作過程的中表

6、面分子效應的內(nèi)在化過程。（3）病害表型是互作的結(jié)果，變化復雜。,3.主要研究方法（main strategy） ◆ 從“里”到“外”：以研究寄主和病原物的基因為主要對象，闡明寄主－病原物相互作用的有關基因的結(jié)構、表達、調(diào)控及其產(chǎn)物功能。（傳統(tǒng)植物病理學從外到里）。　 ◆ 方 法導向：先以分子克隆的方法鑒定與致病性有關的基因，然后根據(jù)該基因產(chǎn)物及其對生物表型的影響，確定該基因的類型和作用。（傳統(tǒng)植物病理學為概念導向）　

7、 ◆ 在分子（DNA）水平上通過互補分析和缺失研究，從個體到群體分析有關基因的作用和功能表現(xiàn)的調(diào)節(jié)。（傳統(tǒng)植物病理學則多采用比較研究的方法）。,4. 分子植物病理學的研究任務,是用分子生物學方法研究植物病理學問題，從而闡明寄主-病原互作過程中有關基因的作用及其產(chǎn)物對病程發(fā)展的影響。研究病原物的致病基因及其表達和寄主植物的抗病性、感病性基因及其表達是其兩大主要任務。還包括病原-寄主互作的遺傳學，以及植物抗病基因工程等問題。,主要章

8、節(jié)與內(nèi)容,第一章 寄主-病原物相互作用的遺傳和生理生化基礎第二章 病原物致病相關基因第三章 寄主植物的抗病基因第四章 植物的防衛(wèi)反應基因第五章 寄主-病原物相互作用第六章 信號接受和信息傳遞第七章 植物抗病基因工程的基本原理和方法,5. 分子植物病理學的發(fā)展歷史（history）,分子植物病理學是植物病理學中最年輕的分支，是在遺傳學、細胞生物學、分子生物學、生物化學和生物物理學等現(xiàn)代學科發(fā)展和影響下逐漸形成的。20世紀8

9、0年代以來分子植物病理學與脫穎而出。以DNA重組為主要研究手段，以研究寄主-病原物互作中基因及其表達為主要特征，以病原致病性機理和寄主抗、感病性機理研究為主要內(nèi)容。標志：1986年在《Phytopathology》上出現(xiàn)標題欄目Molecular plant pathology，《Physiological Plant pathology》改版為《 Physiological and Molecular Plant patholog

10、y》，以及1988年《 Molecular Plant-microbe interactions》的創(chuàng)立。,由于各種病原物的分類地位及其所從屬的學科不同，因此，在各種植物病害的研究中，運用分子植物病理學觀點和方法對其進行研究的水平是不平衡的。,5.1 植物病毒病害的分子生物學研究,1935，W. M. Stanley 成功分離出TMV結(jié)晶，并證明結(jié)晶的大部分組成是protein（獲1945年諾貝爾獎）. 1937, E. C.

11、Borden ﹠N. w. Pirie 報道了TMV的化學組成，提出該病毒由95％protein 和5％RNA組成．,1955～1956，H. Frankel-Conrat 對TMV的蛋白質(zhì)和核酸進行了重組研究，為證明核酸作為一種遺傳物質(zhì)的作用提出了令人信服的證據(jù)．(病毒分子病理研究經(jīng)典之作),1958,Gierer et al,用亞硝酸誘變獲得TMV突變株,使壞死病斑從0.2%增加到15%,進一步說明病毒RNA的突變與致病功能的關系

12、.,5.2 植物細菌病害的分子生物學研究 植物病原細菌中歐氏桿菌歸屬于腸桿菌科，這類病原菌的分子遺傳研究在20世紀70年代初才開始，較肺炎雙球菌的分子遺傳學研究遲了近40年，較DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)晚了將近20年。 20世紀50～70年代是植物病原細菌基因操作技術積累的時期。 1953～1956，D.T. Klein ﹠R. M. Klein 發(fā)現(xiàn)根癌土壤桿菌的基因轉(zhuǎn)化與致

13、病性有關的現(xiàn)象。 1957， R.R.Corey﹠M.P.Starr 發(fā)現(xiàn)了菜豆黃單胞的轉(zhuǎn)化作用與其對鏈霉素抗性和菌落形態(tài)變化之間的關系。 1966，日本學者完成了水稻白葉枯病菌的轉(zhuǎn)化研究。,歐氏桿菌(Erwinia spp),歐氏桿菌與大腸桿菌相近,同時也是重要植物病原細菌,因此開始分子遺傳學研究較早。20世紀70年代,M.P.Starr實驗室進行了歐氏桿菌Hfr菌株的結(jié)合遺傳學研究，，利用

14、營養(yǎng)缺陷型標記轉(zhuǎn)移法對其致病基因進行作圖,結(jié)果表明,致病基因位于染色體上his和thr兩個基因之間.,自1984年N.T.Keen首次報道從菊歐氏桿菌(E.Chrysanthemi)中克隆到果膠裂解酶基因后,發(fā)表了有關歐氏桿菌中2個種pel 基因克隆的報道,其中涉及編碼5個主要同工酶的5個pel基因.,農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） 1944, 發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染的植物組織可以在不加激素的培養(yǎng)基上生長。

15、 1970，G.Morel et al.發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌致病菌有兩種類型，其區(qū)別在于對兩種不常見Arg衍生物章魚堿（octopine）和胭脂堿（nopaline）的代謝不同。 1973,J.A.Lippincoot證明，無致病力菌株喪失對上述兩種Arg衍生物的利用能力，因此，農(nóng)桿菌有3種類型。,細菌利用 腫瘤組織合成,1974～1978，農(nóng)桿菌菌株的遺傳轉(zhuǎn)化研究。其中，1977， M.D

16、.Chilton證明農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上只有一小段DNA與腫瘤誘發(fā)有關系，而且可以從細菌轉(zhuǎn)移到植物細胞；1978，J.Schell 首次以Ti為載體把帶有抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)座子Tn7轉(zhuǎn)移到植物細胞中去，開創(chuàng)了以Ti質(zhì)粒為載體轉(zhuǎn)移外源DNA進入植物的植物基因工程研究日益興旺，同時對Ti質(zhì)粒的精細分析和與寄主植物互作的研究成為分子植物病理學研究熱點.,假單胞細菌(Pseudomonas.spp.),茄青枯假單胞(P.solanacearum)

17、;丁香假單胞(P.syringae)大豆斑點病菌(P.s.pv.glycinea);大豆假單胞(P.glycinea),5.3 植物真菌病害的分子生物學研究,傳統(tǒng)植物病理學中許多重要的理論和學說都是以真菌病害為模式發(fā)展起來的,但在分子病理學方面的進展明顯滯后. 1979年M.E.Case在粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)和J.Tilburn在巢曲霉(Aspergillus)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)試驗相繼取得成功后,絲狀植物

18、病原真菌的分子生物學研究發(fā)展迅速.最初主要采取萌發(fā)包子和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化.,植物病原真線蟲等其它病原物分子水平研究,明顯落后主要是受遺傳轉(zhuǎn)化技術限制。線蟲主要采取基因沉默技術。,6 分子植物病理學的研究進展和發(fā)展趨勢,6.1 基因?qū)蚣僬f 植物對某種病原菌的特異性抗性取決于它是否具有抗性基因，即寄主分別含有感病基因（r）和抗病基因（R），病原分別含有有毒基因（vir）和無毒基因（avr），只有當具有抗性基因的植物

19、與具有無毒基因的病原相遇時，才能激發(fā)植物的抗病反應，其他情況下二者表現(xiàn)親和，即寄主表現(xiàn)感病。,Gene for Gene Hypothesis,在抗病組合中，植物有R基因，則病原物有非毒性 avr 基因,,,植物R 基因受體 receptor,Rx,rr,,,,,病 原,Ax,aa,R,S,S,S,植 物,Avrelicitor,+,_,+,_,R,S,S,S,'Gene-for-gene' (race-specifi

20、c) interactions (Flor in 1956),In studying the interaction between flax and the flax rust fungus, Flor noted that resistance of plants is determined by single dominant resistance (R) genes in the plant and corresponding

21、avirulence (avr) genes in the pathogen. Only if the corresponding genes are present in the two interacting organisms does resistance occur.,'Gene-for-gene' (race-specific) interactions (Flor in 1956),In studying

22、the interaction between flax and the flax rust fungus, Flor noted that resistance of plants is determined by single dominant resistance (R) genes in the plant and corresponding avirulence (avr) genes in the pathogen. Onl

23、y if the corresponding genes are present in the two interacting organisms does resistance occur.,,6.2 病原菌致病相關基因的研究進展 致病性基因(Pathogenicity genes)是病原均與寄主植物互作過程中決定對植物致病性的基因。它決定著病原菌在寄主植物過程中與植物建立寄生關系，破壞寄主植物細胞正常生理代謝功能以及調(diào)控對植物

24、的吸附、侵染、定植擴展和最終顯癥等過程。致病基因主要包括毒性基因和無毒基因,前者決定對植物表現(xiàn)親和性,即調(diào)控病害的發(fā)生與發(fā)展;后者決定病原菌小種與含相應抗病基因的寄主植物品種表現(xiàn)?；圆挥H和。,6.3 病原無毒基因及其進展,(Avirulent genes)廣泛存在于寄主植物的病原中，Staskawicz et al （1984）通過把含無毒基因avrA的大豆丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringaepv.glycinea

25、)6號小種的Cosmid克隆接合轉(zhuǎn)移到不含avrA的小種中，以遺傳互補實驗，克隆了avrA，這是克隆的第一個無毒基因。隨后，許多研究者通過類似的方法從不同的病原(包括細菌、真菌和病毒)中克隆了50多個無毒基因，涉及40～50種病原物。,植物病毒無毒基因的研究,TMV等近10種病毒的無毒基因已得到研究，現(xiàn)已明確的病毒無毒基因產(chǎn)物均為病毒致病相關功能蛋白，包括病毒外殼蛋白、復制酶蛋白和運動蛋白。 1986,Beachy,

26、et al.將TMV U1株的外殼蛋白cDNA轉(zhuǎn)入煙草細胞，獲得了高抗性的煙草植物，此后，利用外殼蛋白基因獲得抗病毒病植物的方法很快被應用到其他病毒和植物上。 病毒：TMV，ALMV，CMV，TRV， PVX，PVY，SMV，BMV，RSV 寄主： 煙草，番茄，馬鈴薯，大豆，水稻,植物病原細菌無毒基因的研究,自第一個植物病原細菌無毒基因avrA從丁香假單胞菌大豆致

27、病變種6號生理小種中被克隆后，目前已從丁香假單胞菌、甘藍黑腐黃單胞桿菌的不同變種和青枯假單胞菌等植物病原細菌中克隆了40多個無毒基因，遠遠超過從其它植物病原菌中克隆到的無毒基因。 細菌無毒基因產(chǎn)物在植物細胞內(nèi)的定位及氣與激發(fā)子HR的關系是近年來的研究熱點之一。研究結(jié)果表明，無毒基因產(chǎn)物實現(xiàn)其激發(fā)子功能的場所不在胞外空間，而是依賴于功能性hrp(Hypersensitive responses and pathogeni

28、- city)基因產(chǎn)物直接將無毒基因產(chǎn)物從菌體內(nèi)轉(zhuǎn)移到寄主細胞質(zhì)內(nèi)，從而實現(xiàn)其激發(fā)子功能。,應用植物基因工程技術將具有能激活植物自身防御系統(tǒng)的無毒基因與適合于植物背景、非專一性的病原物誘導啟動子組合成嵌合基因構建到植物表達載體中。通過農(nóng)桿菌或基因槍的介導轉(zhuǎn)化植物,可篩選出高效廣譜的抗真菌和細菌病害的轉(zhuǎn)基因植株。 楊希才等(2001)從病原細菌Pseudomonas syringae PV.tomato中獲得的無毒基因avrD(

29、0.93kb)和從病原真菌Phytophthoraparasitica中獲得的無毒基因Elicitin(0.294kb)分別與非專一性病原物誘導啟動子Pill和BG組成含2個嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表達載體pYH144和pYHEt。通過農(nóng)桿菌LBA4404介導轉(zhuǎn)化馬鈴薯,其中用pYH144載體轉(zhuǎn)化2個品種(克新1號,2號),用pYHEt載體轉(zhuǎn)化3個品種(Desiree,克新2號,4號),通過組織培養(yǎng)分

30、別獲得潮霉素(Hygromycin B)標記的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯試管苗,對馬鈴薯晚疫病具有明顯的抗性。,植物病原真菌無毒基因的研究 由于缺乏簡便有效的克隆方法,真菌無毒基因的克隆落后于細菌無毒基因以及相應植物抗病基因的克隆,這已成為進一步研究克隆抗病基因與真菌無毒基因產(chǎn)物互作及下游信號轉(zhuǎn)導途徑的制約因素之一。,番茄葉霉病菌（Cladosporium fulvum）的無毒基因 現(xiàn)已從不同番茄品種中鑒定了許多抗性基因，這些基因

31、的近等位基因系對已知的病原小種表現(xiàn)明顯的不同反應, 被侵染葉片的非原生質(zhì)體汁液中含有真菌結(jié)構蛋白和定植期間被誘導產(chǎn)生的蛋白。其中之一是無毒基因avr9的產(chǎn)物，與番茄抗病基因cf9的產(chǎn)物特異性互作。 目前，已對avr9基因產(chǎn)物進行了純化和測序，明確了其分子結(jié)構，為一個63個AA的前體蛋白，C末端含有28個AA的成熟激發(fā)子，因此，可以從蛋白質(zhì)到基因的克隆途徑來鑒定基因。所分離的基因克隆表明，avr9的ORF中有一個59

32、bp的短內(nèi)含子。 能在cf4基因型的番茄上誘導過敏反應的小種?；图ぐl(fā)子及無毒基因avr4的產(chǎn)物也已被純化和測序并以相同的方法克隆到無毒基因avr4。,,,稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的無毒基因,稻瘟病是世界性重要病害，現(xiàn)已作為模式病害，從經(jīng)典遺傳學、分子生物學核細胞生物學等不同的角度進行了全方位的分子病理學研究。 《Rice Blast Disease》Zeigler, et

33、 al. 1994 在已鑒定克隆的8個 pwi 基因（pathogenicity of weeping lovegrass,對畫眉草致?。?pwi 1基因是從馬唐與畫眉草菌株雜交后鑒定出來的，對畫眉草的致病性發(fā)生了變化，因此，根據(jù)經(jīng)典的無毒基因控制一種寄主植物品種轉(zhuǎn)化性的概念預測pwi 2基因有阻止對畫眉草侵染的作用。目前用染色體步查的方法已克隆了pwi 2基因，并進行了測序。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)水稻菌株含有1到數(shù)個p

34、wi 2拷貝。通過研究具有不同寄主?；缘牡疚敛【阷wi 2同源序列的分布，發(fā)現(xiàn)pwi是一個多基因家族。,亞麻柵銹病菌（Melampsora lini）無毒基因 亞麻銹病的寄主－病原物關系是研究最充分的病例。目前已鑒定出34個抗病基因分別存在于7個群中。 用?射線進行缺失誘變克隆到4個無毒基因。但目前對亞麻銹病菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還不十分成熟。,大麥云紋病菌（Rhynchosporium secalis）無毒基因,大麥近等位基

35、因系Atlas對小種US138.1是感病的， Atlas46帶有抗病基因Rrs1是對小種US138.1抗病的。 Atlas ╳ Atlas46第一代、第二代對小種US138.1抗性遺傳分析表明，這種抗性是由單個共顯性基因控制的。小種US138.1產(chǎn)生的3種能誘導細胞壞死的多肽NIP1、NIP2和NIP3在兩個品種上誘導壞死的能力是相同的。 NIP1、NIP2的存在與不親和互作中壞死的發(fā)生有關，在親和互作中不產(chǎn)生過敏反應。在小種US138

36、.1的不親和互作中病程相關蛋白PRHv-1的mRNA的積累水平比在親和互作中高，而且只有US138.1產(chǎn)生的NIP1能特異地誘導帶Rrs1抗病基因的品種產(chǎn)生PRHv-1的mRNA。因此， NIP1可能是一種無毒基因。該基因的克隆和轉(zhuǎn)化研究正在進行。,6.4 植物抗病基因的研究 自Johal,et al(1992)成功克隆出第一個玉米抗圓斑病R基因Hm1以來，迄今人們已經(jīng)從9種不同植物中成功地克隆出了22種R基因?？寺≈参颮

37、基因一般采用產(chǎn)物導向法(product-orientated approaches)、鳥槍射擊法(shot-gun complementation)、扣除雜交法(subtractive hybridization)、轉(zhuǎn)座子標記法(transposon tagging)和圖位克隆法(map-based cloning)等7種方法，但只有轉(zhuǎn)座子標記法和定位克隆法取得了成功。上述22種R基因都是采用這兩種方法克隆的。,已 克 隆 的 植 物

38、抗 病 基 因,隨著分子生物學技術在分子植物病理學中的廣泛應用，尤其是抗病基因的成功克隆與分析，對植物抗病基因的分子功能已有一定的實驗依據(jù)。B.Baker和K.E.Hammond-Kosack等（1997）分別從寄主－病原物相互作用和克隆分離的抗病基因結(jié)構特征闡述了植物抗病基因的功能即識別、信號傳導和進化。 有待解決的問題： ∮在抗病基因產(chǎn)物中那些結(jié)構決定病原物的特異性識別？ ∮其下游信號物質(zhì)是什么？這些物質(zhì)