山東省濟南市區(qū)廢水環(huán)境中整合子細菌篩選及耐藥性機制研究.pdf

1、近年來由于抗生素的廣泛應用治療各類感染，使細菌耐藥問題越來越嚴重，從而導致了細菌多重耐藥性(Multidrug resistance，MDR)的現(xiàn)象。不斷的濫用抗生素使得人體乃至自然環(huán)境為細菌進化為多重耐藥性細菌提供了選擇壓力并使細菌耐藥性得以廣泛的傳播。整合子是一種可移動元件，在整合酶作用下，識別重組位點，通過位點特異性重組剪切、捕獲并整合細胞外游離的基因盒，并借助整合子的強啟動子使功能性基因得以表達的遺傳系統(tǒng)；整合子的基因盒大部分是

2、具編碼多種水解酶或修飾酶、外排泵等與細菌耐藥性相關基因。
　　 臨床上具有不同耐藥基因的致病菌會以各種方式流入環(huán)境中，環(huán)境細菌通過基因的水平轉移，可以從流入環(huán)境中的臨床致病菌中獲得耐藥性基因。在耐藥基因轉移過程中，往往會發(fā)生突變或重組，進而產(chǎn)生新的耐藥基因或新的多重耐藥性基因的組合。反過來，這些新的耐藥因子有可能再從環(huán)境細菌轉入臨床致病菌，經(jīng)過空氣、食物或水來感染人體，在臨床上產(chǎn)生耐藥性，對人類健康具有極大的危害。在抗菌藥物選擇

3、壓力環(huán)境下，整合子隨轉座子、接合性質粒一同發(fā)生水平轉移具有使耐藥性在細菌之間傳播的功能，是細菌競爭生存、適應環(huán)境的機制之一，也是耐藥性傳播的重要途徑。
　　 我們這項研究是通過調(diào)查濟南地區(qū)醫(yī)院周邊生活廢水中整合子細菌的發(fā)生率以及其含有的耐藥基因盒結構，目的是發(fā)掘、鑒定一些新型的整合子結構。從基因水平上分析細菌的耐藥及其轉移的機制，說明抗菌藥物濫用的危害性從而指導抗菌藥物的正確使用，防止抗菌藥物的濫用；根據(jù)細菌耐藥的機制，有目的的

4、開發(fā)一些新型抗菌藥物。
　　 本文主要的工作內(nèi)容及結果如下：
　　 1.通過膜過濾法從濟南市區(qū)廢水環(huán)境中篩選耐藥性細菌，對所有耐藥性菌株的1型、2型、3型整合酶通過PCR分別進行檢測
　　 從2008年至2009年各大醫(yī)院廢水處理廠周邊的廢水樣品；濟南齊魯制藥廠下游小清河地下水、工程改造地下抽去的排水及藥廠豬圈廢水；廢水處理廠處理前廢水及部分天然少污染的濟南周邊泉水共15個不同時間的樣品進行分析。篩選出391株不

5、同耐藥性腸桿菌菌株，根據(jù)CLSI標準，通過抗菌藥物敏感性實驗分析菌株對常用抗菌藥物耐藥性，發(fā)現(xiàn)菌株對氨芐西林、甲氧芐啶、硫代異唑的耐藥性大于85％。通過1、2、3型整合酶引物intI1F/R，intI2F/R和intI3F/R進行PCR檢測，其中1型整合子比率為59.3％，2型整合子的比率為9.2％，未篩選到3型整合酶陽性的菌株。391株菌株藥物敏感性結果與整合子篩選結果分析發(fā)現(xiàn)，含有整合子的耐藥細菌對氨芐西林、甲氧芐啶和硫代異唑三種抗

6、菌藥物的耐藥率高達90％以上，非整合子細菌氨芐西林的耐藥性也高達87.2％，除了磷霉素外，耐藥性含整合子細菌比不具有該結構的菌株耐藥性的比率高10％～20％。
　　 2.對1型整合子可變區(qū)采用PCR擴增，通過PCR產(chǎn)物大小、PCR產(chǎn)物RFLP圖譜分析及測序結果機型分析
　　 根據(jù)1型整合子可變區(qū)根據(jù)其保守的5'CS和3'CS設計引物hep58，hep59進行擴增。根據(jù)PCR產(chǎn)物大小從0.2kb至6.3kb，PCR產(chǎn)物Ec

7、oRⅡ酶切圖譜分析，發(fā)現(xiàn)34種不同酶切圖譜，測序結果發(fā)現(xiàn)35種不同的基因盒陣列，具有42種不同的基因盒。35種基因盒陣列中九種基因盒陣列屬于新的排列組合，16SrRNA分析，九株菌包含6個屬：氣單胞菌屬、克雷伯菌屬、大腸桿菌屬、從毛假單胞菌屬、普羅維登斯菌屬和奇異變形桿菌屬。9種新型基因盒陣列如下所示：orfⅠ；arr3-dfrA27；aadA△16-acc(6′)-Ⅱ；aac(6′)-Ⅰb-blaOXA-1-catB3；aacA4-o

8、rfun-aacA4-catB3；dhfrⅤ-aac(6′)-Ⅱ-nit1-nit2-catB3-blaOXA-1；aac(6′)-Ⅰb-cr-arr3-dfrA27-aadA16-ⅠS26aadB-cat-blaOXA-10-aadA1-dfrA1-aacA4aadB-cat-blaOXA-10-aadA1-orfⅡ。232株具有1型整合子的基因盒陣列中，dfrA17-aadA5排列方式是最多的一種，占43.5％，其次是dfrA12-

9、orfF-aadA2陣列，占19.3％。
　　 3.對共篩選出36株2型整合子進行分析，其中含有5種不同的基因盒排列組合，接合轉移及轉化方法分析2型整合子的水平轉移性
　　 用于擴增2型整合子可變區(qū)hep74和hep51引物成功擴增到5種不同的PCR產(chǎn)物4.3kb，3.0kb，2.Skb和2.2kb及時隱時現(xiàn)的2.5kb片段大小。PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T測序結果顯示分別為linF-dfrA1-aadA1-orf44

10、1；dfrA1-catB2-sat2-aadA1；estⅩvr-sat-aadA1，dfrA1-sat2-aadA1及雜合型的dfrA1-sat2-aadA1-qacH基因盒陣列。36株2型整合子細菌根據(jù)PEP圖譜進行分類，發(fā)現(xiàn)其可以分為15類，16S rRNA測序結果顯示19株屬于奇異變形桿菌屬，大腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬各7株，費氏檸檬酸桿菌、志賀氏菌屬、不動桿菌屬各1株。接合轉移、轉化實驗及脈沖場電泳及Southern雜交實驗結果

11、表明除E.coli C4雜合型2型整合子外，其余新型2型基因盒陣列均位于染色體上。采用Tn7類轉座子特有序列tnsD，tnsE進行檢測，除2株雜合型2型整合子不具有此類保守序列外，其余34株2型整合子均屬于Tn7轉座子家族。在雜合型2型整合子下游鑒定存在IS26，tnp440和sul3基因。
　　 4.Aeromonas puctata中新型喹諾酮耐藥性基因qnrVC4的克隆及活性分析
　　 從Aeromonas puc

12、tata基因盒3.3kb aacA4-orfun-aacA4-catB3比對結果發(fā)現(xiàn)中間1kb序列功能未知，具有218氨基酸的開放閱讀框，GenBank比對結果顯示其與QnrB6，QmrA1，QnrS1，QnrC，QnrVC1和QnrVC3具有45％-81％的相似性。根據(jù)核苷酸、氨基酸序列相似性及其attC重組位點進行了詳細的分析，根據(jù)qnr基因命名的法則，將此基因命名為qnrVC4。接合轉移和轉化實驗均未獲得該菌株相應的轉移子。采用堿

13、裂解法提取質粒，脈沖場電泳，23S rRNA探針雜交對染色體定位，然后用qnrVC4探針進行雜交分析，結果表明該基因位于一大質粒上，并且該質粒不可以發(fā)生水平轉移。利用pBC KS(+)的Lac啟動子及整合子本身的啟動子PcWTGN-10進行表達。將657bp的qnrVC4及含有啟動子、aacA4、qnrVC4基因的1.8kb的PCR產(chǎn)物克隆至質粒pBC KS(+)中，在E.coliTop10中成功構建重組子pBCKS-qnrVC4和pB

14、CKS-Pt-qnrVC4。重組子pBCKS-qnrVC4對環(huán)丙沙星、加替沙星、萘啶酮酸最小抑菌濃度(MICs)結果分別為0.032，0.047和4μg/mL；重組子pBCKS-Pt-qnrVC4結果分別為0.008，0.006和2μg/mL。分析此菌株染色體上GyrA，GyrB和ParC的喹諾酮耐藥性決定區(qū)域(QRDR)發(fā)現(xiàn)GyrA Ser-83-Ile突變是該菌株喹諾酮耐藥性的主要原因。
　　 5.分析391株耐藥細菌中質粒

15、介導的喹諾酮耐藥性基因qnrA，qnrB，qnrS的分布
　　 雖然QnrA，QnrB和QnrS蛋白在喹諾酮耐藥性的貢獻非常小，但是qnrA，qnrB和qnrS通常位于質粒上并成為喹諾酮耐藥性水平轉移的主要方式，并且此類基因的水平轉移為獲得高喹諾酮耐藥性提供可能。從391株篩選的不同耐藥菌株中31株具有qnr類基因，其中2株具有qnrA基因；9株具有qnrS基因陽性菌株；17株qnrB基因陽性菌株，3株同時含有qnrB，qnrS

16、基因。通過兩對引物進行PCR，并且通過PCR-RFLP的方法對qnrB基因變體進行了詳細的分析，此分析法的結果與測序結果相一致，可以用來大量快速鑒定qnrB基因變體并發(fā)現(xiàn)新型qnrB變體。與喹諾酮耐藥性相關的aac(6')-Ⅰb-cr基因與qnr基因同時存在可以提高喹諾酮耐藥性，在31株菌中檢測到12株菌具有該基因。與喹諾酮相關的外排泵基因qepA僅在1株qnrB菌株中和4株qnrS菌株中檢測到。接合轉移和轉化實驗結果發(fā)現(xiàn)18株菌株的q

17、nr基因可以發(fā)生水平轉移。
　　 6.調(diào)查391株耐藥性菌株中ISCR1介導的復雜結構的1型整合子及具有該元件菌株的耐藥性機制分析
　　 本實驗調(diào)查了391株菌株含有ISCR1元件的概率，發(fā)現(xiàn)其中有41株具有ISCR1元件，包括所有含有qnrA，qnrB的菌株。采用ISCR1元件的保守序列設計引物513BF和3'CS的qac△EB引物及SEFA-PCR分析ISCR1元件下游所攜帶的耐藥性基因，從中發(fā)現(xiàn)了11種不同的結構，

18、包括ISCR1-qnrA-ampR-qac△E-sull，SCR1-qnrB2-qac△E-sull，ISCR1-qnrB6-qac△E-sull，ISCR1-dfrA10-qac△E-sull，ISCR1-tnpU-armA，ISCR1-dfrL-qac△E-Sull，ISCR1-dfrM-qac△E-sull，ISCR1-dfrN-qac△E-sull，ISCR1-dfrA19-intⅠ1-catB3-aadB-qac△E-sull