多花木藍(lán)鹽脅迫的生理響應(yīng)試驗(yàn)方案

1、多花木藍(lán)鹽脅迫的生理響應(yīng)試驗(yàn)方案多花木藍(lán)鹽脅迫的生理響應(yīng)試驗(yàn)方案材料和樣品：多花木蘭種子、NaCl、完全培養(yǎng)液（硝酸鈣1克、磷酸二氫鉀0.25克、硫酸鎂0.25克、氯化鐵0.25克、氯化鉀或硝酸鉀0.25克）、蒸餾水。溶液培養(yǎng)皿設(shè)置：設(shè)置5組不同培養(yǎng)條件，選擇飽滿、均勻、外觀良好的種子，放入溶液培養(yǎng)皿中，每皿30粒，分別加入相同量的完全培養(yǎng)液及6ml不同濃度的NaCl溶液（濃度梯度：0gL、2gL、4gL、8gL、12gL），編號(hào)1、2

2、、3、4、5，第1組為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。將培養(yǎng)皿置于溫室中培養(yǎng)，每天下午3時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充蒸發(fā)水分，以維持鹽分濃度的穩(wěn)定。培養(yǎng)相同時(shí)長(zhǎng)，待多花木藍(lán)長(zhǎng)出幼苗后，分別測(cè)定5組多花木藍(lán)幼苗的各項(xiàng)指標(biāo)。一、多花木藍(lán)幼苗生長(zhǎng)特性指標(biāo)測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定：記錄每組植株成活數(shù)量，計(jì)算成活率；用直尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量株高、莖粗、最大側(cè)根長(zhǎng)。根系活力的測(cè)定根系活力的測(cè)定：TTC法材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料：水培的多花木藍(lán)根系。（二）儀器

3、設(shè)備：分光光度計(jì)；分析天平（感量0.1mg）；電子頂載天平（感量0.1g）；溫箱；研缽；三角瓶50ml；漏斗；量筒100ml；吸量管10ml；刻度試管10ml；試管架；容量瓶10ml；藥勺；石英砂適量；燒杯10ml、1000ml。（三）試劑：1）乙酸乙酯（分析純）；2）次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末；3）1%TTC溶液：準(zhǔn)確稱取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100ml，用時(shí)稀釋至各需要的濃度；4）磷酸緩沖液（115mol

4、L1，pH7）。5）1molL1硫酸：用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml；6）0.4molL1琥珀酸：稱取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.

5、00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稱取5組根尖樣品各0.5g，每組取三次，分別編號(hào)11、12、13，21、22、23，31、32、33，41、42、43，51、52、53，放入10ml燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把

6、根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37℃下暗保溫1～3h，此后加入1molL1硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做5個(gè)空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲腙。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於⑷?，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量?0ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。

7、的研缽中，1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.5～2ml于1000rpm下離心20min，上清液即為SOD粗提液。2.顯色反應(yīng)取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下表加入各溶液試劑（酶）用量ml終濃度（比色時(shí)）0.05molL磷酸緩沖液1.5130mmolLMet溶液0.313mmolL750μmolLNBT溶液0.375μmolL100μmolLEDTA－Na2液0.

8、310μmolL20μmolL核黃素0.32.0μmolL酶液0.052支對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.25總體積3.0混勻后將1支對(duì)照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3.SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管做空白，分別測(cè)定其它各管的吸光度。結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性

9、＝(Ack－AE)V(Ack0.5WVt)式中：Ack為照光對(duì)照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液總體積（ml）Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量（ml），W為樣品鮮重（g），蛋白質(zhì)含量單位為：mg蛋白／g鮮重。丙二醛丙二醛(MDA)(MDA)含量測(cè)定含量測(cè)定:硫代巴比妥酸法材料、儀器設(shè)備及試劑1實(shí)驗(yàn)材料：多花木藍(lán)幼苗的葉片2.儀器：分光光度計(jì)，研缽，剪刀，恒溫水浴，試管20mL4，離心機(jī)。3.試劑：5%三氯醋酸；0.5%硫代巴比妥酸（用5