兩種定量分析方法的比較及taqman探針引物設(shè)計原則

1、兩種定量分析方法的比較及Taqman探針、引物設(shè)計原則遺傳物質(zhì)DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成為信使RNA（mRNA）攜帶遺傳信息的mRNA從細胞核進入到細胞質(zhì)中與核糖體結(jié)合，在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經(jīng)過進一步加工后變成蛋白質(zhì)，至此遺傳物質(zhì)DNA完成了表達過程。期間的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達中非常重要的調(diào)節(jié)步驟，所轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少直接影響著相關(guān)最終蛋白質(zhì)的多少，所以通過對細胞內(nèi)某條基因mRNA含量多少的分析

2、，就能大致判斷出該條基因的表達是否活躍。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，PCR擴增和檢測同時進行；在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。該技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高

3、等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。定量定量PCR常用的三個常用概念常用的三個常用概念擴增曲線、熒光閾值、Ct值擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強度的曲線，定量PCR儀每次輪PCR擴增都會自動記錄熒光強度的變化熒光閾值：樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，手動設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。CT值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)

4、過的擴增循環(huán)次數(shù)。擴增曲線閾值及CT值熒光定量光定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：X=X02n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1Ex)n（n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)；X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量；X0：初始模板量；Ex：擴增效率）C(t)value段的目的基因的量和內(nèi)參基因的量相除，得出一個比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達變化。公式如下：雙標(biāo)準(zhǔn)曲準(zhǔn)曲線法的特點：法的特點：1考慮到了不同基

5、因擴增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴增效率，最大限度的避免了誤差；2思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡便，無需像DeltadeltaCT法那樣對實驗進行嚴(yán)格的優(yōu)化；3其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線；4該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。二、二、2△△△△CT法公式如下：1、2△△△△CT方法的推方法的推導(dǎo)PCR指數(shù)擴增的公式是：Xn是第n個循環(huán)后目標(biāo)分子數(shù)；X0是初始目標(biāo)分子數(shù)；Ex是目標(biāo)分子擴增效率；n