生物質(zhì)譜分析

1、生物分析技術(shù),第5講 生物質(zhì)譜分析,2011年10月,第一節(jié) 概述第二節(jié) 質(zhì)譜儀第三節(jié) 生物質(zhì)譜的應(yīng)用,,主要內(nèi)容,質(zhì)譜分析法(Mass Spectroscope,MS)是將化合物形成離子或碎片離子，按質(zhì)荷比(m/z)的不同進(jìn)行測(cè)定，從而進(jìn)行成分分析和結(jié)構(gòu)分析的一種方法。根據(jù)質(zhì)譜分析法的結(jié)果（質(zhì)譜圖）所提供的信息可以進(jìn)行有機(jī)物、無(wú)機(jī)物的定性和定量分析，生物大分子的結(jié)構(gòu)分析，同位素的測(cè)定及固體表面的結(jié)

2、構(gòu)和組成分析。 生物質(zhì)譜就是用于生物分子分析的質(zhì)譜技術(shù)。由于生物分子大多數(shù)以其高相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)別于分子質(zhì)量在幾十到幾千的無(wú)機(jī)或有機(jī)小分子，因而，生物質(zhì)譜要求測(cè)定上萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)的分子質(zhì)量。,第一節(jié) 概述,早期，質(zhì)譜分析法僅限于小分子和中等分子的研究，因?yàn)橐獙①|(zhì)譜應(yīng)用于生物大分子需要將其制備成氣相帶電分子，然后在真空中物理分解成離子。如何使蛋白分子經(jīng)受住離子化過(guò)程而又不喪失其結(jié)構(gòu)形態(tài)是個(gè)難題。20世紀(jì)70年代，解吸技術(shù)的

3、出現(xiàn)成功地將蛋白分子轉(zhuǎn)化成氣相離子，而后快原子轟擊與其緊密相關(guān)的溶液基質(zhì)使得具有極性、熱不穩(wěn)定的蛋白分子可經(jīng)受住電離過(guò)程。但這些方法僅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MAILDI) 技術(shù)的發(fā)展則使得質(zhì)譜方法成功應(yīng)用于高分子量蛋白分子的研究。,1906年 J.JThomson在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)帶電荷離子在 電磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)軌跡與它的質(zhì)

4、荷比有關(guān) 并于1912年制造出第一臺(tái)質(zhì)譜儀 1946年 飛行時(shí)間質(zhì)量分析器 1953年 四極桿質(zhì)量分析器 1959年 質(zhì)譜儀首次用于多肽測(cè)序 1965年 離子共振質(zhì)譜 1968年 電噴霧離子源 1974年 傅里葉變換離子回旋共振分析器 1987年 基質(zhì)輔

5、助激光解吸電離質(zhì)譜,質(zhì)譜儀的發(fā)展歷史,日本科學(xué)家田中耕一(Koichi Tanaka)1959年出生于日本富山縣首府富山市，1983年獲日本東北大學(xué)學(xué)士學(xué)位，現(xiàn)任職于京都市島津制作所，為該公司研發(fā)工程師，分析測(cè)量事業(yè)部生命科學(xué)商務(wù)中心、生命科學(xué)研究所主任。他對(duì)化學(xué)的貢獻(xiàn)類似于約翰·芬恩，因此也得到了1／4的獎(jiǎng)金。,美國(guó)科學(xué)家約翰·芬恩1917年出生于美國(guó)紐約市，1940年獲耶魯大學(xué)化學(xué)博士學(xué)位，1967年到1987年

6、間任該大學(xué)教授，1987年起被聘為該大學(xué)名譽(yù)教授，自1994年起任弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)教授。他因?yàn)椤鞍l(fā)明了對(duì)生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的方法”和“發(fā)明了對(duì)生物大分子的質(zhì)譜分析法”而獲得今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1／4的獎(jiǎng)金。,瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼?#183;維特里希1938年生于瑞士阿爾貝格，1964年獲瑞士巴塞爾大學(xué)無(wú)機(jī)化學(xué)博士學(xué)位，從1980年起擔(dān)任瑞士蘇黎世聯(lián)邦高等理工學(xué)校的分子生物物理學(xué)教授，還任美國(guó)加利福尼亞州拉霍亞市斯克里普斯研究所客座教授

7、。他因“發(fā)明了利用核磁共振技術(shù)測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法”而獲得2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)一半的獎(jiǎng)金。,2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者,第二節(jié) 質(zhì)譜儀,一、質(zhì)譜儀的工作原理二、質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu) 1. 真空系統(tǒng) 2. 進(jìn)樣系統(tǒng) 3. 離子源 4. 質(zhì)量分析器 5. 檢測(cè)與記錄,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,離子源,質(zhì)量過(guò)濾/分析器,

8、樣品板LC或GC,,,,EI源FAB源MALDI源ESI源,QuadruopoleIon trapTime-of-flight,電子倍增器閃爍計(jì)數(shù)器,+ + + +,+ + + + + + + + + + + + +,,++,++,+,+,++,+++,+++,+++,+++,一、質(zhì)譜儀的工作原理,樣品導(dǎo)入系統(tǒng),檢測(cè)器,zU=(1/2)m?2 m/z=2U/ ?2,化合物分子在高真空條件下，受高速電子流“轟擊”或強(qiáng)

9、電場(chǎng)其他作用，失去電子生成離子或發(fā)生化學(xué)鍵斷裂成為碎片離子，離子經(jīng)加速器進(jìn)入磁場(chǎng)，其動(dòng)能與加速電壓及電荷遵循：,具有速度?的帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜分析器的電磁場(chǎng)中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比的不同實(shí)現(xiàn)分離。,質(zhì)譜儀的分類,二、質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu),質(zhì)譜儀的構(gòu)造和功能,,計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理,1. 真空系統(tǒng)2. 進(jìn)樣系統(tǒng)3. 離子源4. 質(zhì)量分析器5. 檢測(cè)與記錄,質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器必須在高真空狀態(tài)下工作，一

10、般應(yīng)在10-5～10-6Pa。 (1)真空度差，過(guò)多的氧氣將損耗或燒毀離子源的燈絲； (2)高本低氣壓將干擾質(zhì)譜圖; (3)電離空氣壓過(guò)高，會(huì)發(fā)生離子-分子反應(yīng)，改變碎片譜圖； (4)離子源內(nèi)的高氣壓將干擾電子束的調(diào)節(jié)； (5)電離氣或離子源內(nèi)的高氣壓，可能引起高達(dá)數(shù)千伏的離子加速電壓放電。,1. 真空系統(tǒng),一般質(zhì)譜儀由機(jī)械真空泵(低真空泵)，擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組，使離子源和分析

11、器部分的達(dá)到真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度低。,2. 進(jìn)樣系統(tǒng),要求： 高效重復(fù)的將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低，而樣品導(dǎo)入離子源的方式?jīng)Q定于樣品的物理性質(zhì)。方式： (1)間歇式進(jìn)樣系統(tǒng) (2)直接探針進(jìn)樣 (3)毛細(xì)管進(jìn)樣（從HPLC、GC及CE）,(1)間歇式進(jìn)樣系統(tǒng),可用于氣體、液體和中等蒸汽壓的固體樣

12、品進(jìn)樣，通過(guò)可拆卸式的試樣管將少量固體或液體試樣引入試樣儲(chǔ)存器中。 由于進(jìn)樣系統(tǒng)的低壓強(qiáng)及儲(chǔ)存器的加熱裝置，使試樣保持氣態(tài)。加之進(jìn)樣系統(tǒng)的壓強(qiáng)比離子源的壓強(qiáng)大，樣品分子或離子可以通過(guò)分子漏隙以分子流的形式滲透進(jìn)高真空的離子源。,(2)直接探針進(jìn)樣,通常將試樣放入小杯中，通過(guò)真空閉鎖裝置將其引入離子源，可以對(duì)樣品杯進(jìn)行冷卻或加熱處理。,對(duì)于在間歇式進(jìn)樣系統(tǒng)的條件下無(wú)法變成氣體的固體、熱敏性固體及非揮發(fā)性液體試樣，可直接引入

13、到離子源。 這種進(jìn)樣方式不必使樣品充滿整個(gè)儲(chǔ)存器，因此，可適用樣品量較小和蒸汽壓較低的物質(zhì)。直接進(jìn)樣法擴(kuò)大了質(zhì)譜法的應(yīng)用范圍。,(3)毛細(xì)管進(jìn)樣,,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 從毛細(xì)管氣相色譜柱流出的成分可直接引入質(zhì)譜儀的離子化室。,,,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 采用離子噴霧及電噴霧技術(shù)除去流動(dòng)相使樣品離子進(jìn)入質(zhì)譜分析儀。,質(zhì)譜儀中產(chǎn)生離子的裝置稱為離子源，其功能是將進(jìn)樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉(zhuǎn)化

14、成離子。 不同的分子離子化所需要的能量不同，因此，應(yīng)選擇不同的離解方式： 硬電離：能給予樣品較大能量的電離方法。 軟電離：給予較小能量的電離方法，適用于易 破裂或易電離的樣品。,3. 離子源,(1)電子轟擊電離源 (Electron Impact Ionization, 簡(jiǎn)稱 EI):樣品需經(jīng)過(guò)汽化進(jìn)入電離區(qū)，用約70eV能量的電子束與氣化的試樣分子相互作用，使分子中電離電位較低的價(jià)電子

15、或非鍵電子電離，為硬電離方法。1980年以 前的主要離子化方式， 只能用于有機(jī)小分子 (400Da以下)的電離。,質(zhì)譜技術(shù)中的離子源,電子轟擊電離的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)靈敏度高；有達(dá)10萬(wàn)個(gè)化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)可快速檢索；可根據(jù)碎片方式鑒定未知物；從碎片離子判定結(jié)構(gòu)。,缺點(diǎn)質(zhì)量范圍?。挥锌赡芷鞍l(fā)生解離；碎片過(guò)多有時(shí)看不到分子離子。,質(zhì)譜技術(shù)中的離子源,(2)化學(xué)電離源 (Chemical Ionization

16、, 簡(jiǎn)稱 CI):高能電子束與小分子反應(yīng)氣（如甲烷、丙烷等）作用，使其電離生成初級(jí)離子，這些初級(jí)離子在與試樣分子反應(yīng)得到試樣離子，核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。 (3)場(chǎng)電離 (Field Ionization, 簡(jiǎn)稱 FI):在相距很近的電極間施加高電壓，產(chǎn)生強(qiáng)電場(chǎng)，依靠這個(gè)強(qiáng)電場(chǎng)將附近的試樣分子中的電子拉出來(lái)，使之形成離子。,質(zhì)譜技術(shù)中的離子源,(4) 快原子轟擊源(Fast Atom Bombardment，簡(jiǎn)稱FAB):20世紀(jì)80年代

17、發(fā)展起來(lái)的新離子化方法，是讓稀有氣體（氙氣或氬氣）電離，通過(guò)電場(chǎng)加速，獲得較高動(dòng)能成為快原子，然后轟擊試樣分子， 通過(guò)能量的轉(zhuǎn)移， 使試樣分子電離。,快原子轟擊技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：分子離子和準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)；碎片離子峰豐富；靈敏度高，適用于熱不穩(wěn)定、極性強(qiáng)的分子，如肽類、蛋白質(zhì)、多糖、金屬有機(jī)物等。,快原子轟擊技術(shù)缺點(diǎn)：試樣涂在金屬板上，溶劑也被電離，使質(zhì)譜圖復(fù)雜化。,質(zhì)譜技術(shù)中的離子源,(5)大氣壓化學(xué)電離源 (Atm

18、ospheric Pressure Chemical Ionization，簡(jiǎn)稱APCI):主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，主要用來(lái)分析中等極性、弱極性化合物。APCI主要產(chǎn)生單電荷離子，分析化合物的相對(duì)分子質(zhì)量一般小于1000.,APCI主要部件是一個(gè)雙層套管組成的電噴霧的噴嘴，噴嘴內(nèi)層是液相色譜流出物，外層是霧化氣，通常為大流量的N2，其作用是使噴出的液體分散成微滴。在噴嘴的下游有一個(gè)針狀放電電極，通過(guò)放電電極的高壓放電，使空氣中某些

19、中性分子電離，產(chǎn)生H3O+, N2+, O2+等離子，這些離子與分析物分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。,(6)電噴霧電離 (Electrospray Ionization，簡(jiǎn)稱ESI):是一種使用強(qiáng)靜電場(chǎng)的電離技術(shù)。它主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀或毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既作為色譜和質(zhì)譜之間的接口裝置，同時(shí)又是電離裝置。,質(zhì)譜技術(shù)中的離子源,電噴霧電離是在“離子蒸發(fā)”的原理基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種離子化方法。待測(cè)分子溶解在溶劑

20、中，以液相方式通過(guò)毛細(xì)管到達(dá)噴口，在噴口高電壓作用下形成帶電荷的微滴，隨著微滴中的揮發(fā)性溶劑蒸發(fā)，微滴表面的電荷體密度隨微滴半徑的減少而增加，到達(dá)某一臨界點(diǎn)時(shí)，樣品將以離子方式從液滴表面蒸發(fā)，進(jìn)入氣相，即實(shí)現(xiàn)了樣品的離子化，由于沒(méi)有直接的外界能量作用于分子，因此，對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的軟電離方式。,電噴霧電離最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子，因此，在較小的m/z范圍內(nèi)可以檢測(cè)到大分子質(zhì)量的分子。電噴霧質(zhì)譜目前可測(cè)定分子質(zhì)量在100

21、.000Da以下的蛋白質(zhì)，最高達(dá)150.000Da。適宜相對(duì)分子質(zhì)量大、穩(wěn)定性差的化合物，如極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物，蛋白質(zhì)、肽、糖等。除分析大分子外，電噴霧質(zhì)譜也可分析小分子，對(duì)于分子量在1000Da以下的小分子，也可得到物質(zhì)的分子質(zhì)量。,影響電噴霧電離的因素：樣品的pKa和溶液的pH 樣品離子取決于樣品在噴霧溶液中是否形成離子，正離子檢測(cè)中，溶液pH應(yīng)較低，負(fù)離子檢測(cè)，溶液pH應(yīng)較高。溶劑的性質(zhì)

22、 用于電噴霧電離的溶劑應(yīng)能使樣品在溶液中形成離子，既有較低的溶劑化能力以利于離子蒸發(fā)，具有較低的黏度和表面張力以利于霧化以及具有較低熱容量以利于溶劑化。,電噴霧電離優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)測(cè)定分子質(zhì)量高；靈敏度極高（10-15mol）；軟電離，可觀察生物分子非共價(jià)反應(yīng)；易于和LC串聯(lián)，直接分析流速為1ml/min的LC洗脫液；沒(méi)有基質(zhì)干擾；適于四極桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器做結(jié)構(gòu)分析；帶多電荷，允許質(zhì)量范圍窄的設(shè)

23、備檢測(cè)高質(zhì)量數(shù)的離子，通過(guò)計(jì)算平均值給出更精確的質(zhì)量數(shù)；特別適于測(cè)多肽的修飾；樣品前處理簡(jiǎn)單可直接分析RP-HPLC脫鹽處理的溶液。,電噴霧電離優(yōu)缺點(diǎn),缺點(diǎn)耐鹽能力低；對(duì)某些化合物特別敏感，污染難清洗；樣品需先氣化；帶多電荷，在分析混合物時(shí)，產(chǎn)生混亂；定量時(shí)需內(nèi)校準(zhǔn)。,電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較,電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI

24、源可從0.2到2 ml／min；而電噴霧源允許流量相對(duì)較小,一般為0.2-1 ml／min.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.適用性：通常認(rèn)為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子,(7)基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (Matrix Assisted Laser Desorption，簡(jiǎn)稱MA

25、LDI):是近20年發(fā)展起來(lái)的離子化技術(shù)，特別適用于蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸等生物大分子的離子化。通常用飛行時(shí)間檢測(cè)器作為質(zhì)量分析器，構(gòu)成基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜?？捎糜谏锎蠓肿游镔|(zhì)分子量的測(cè)定；蛋白質(zhì)高通量鑒定；有機(jī)小分子化合物分子量測(cè)定；寡核苷酸的分析；基因的單核苷酸多態(tài)性的分析等。,質(zhì)譜技術(shù)中的離子源,基質(zhì)輔助激光解吸電離工作原理,基質(zhì)輔助激光解吸離子化引入了固體基質(zhì)，使樣品液與基質(zhì)液混合，滴于靶面，在真空中快速干燥，制

26、成極細(xì)的混晶。當(dāng)激光束照射在涂有樣品和基質(zhì)混晶的靶面上時(shí)，基質(zhì)的有機(jī)分子在固態(tài)混晶中共振吸收能量，并將能量傳遞到基質(zhì)有機(jī)物晶體的晶格中，使晶格受到瞬時(shí)強(qiáng)烈擾動(dòng)而解吸出離子或中性分子，并通過(guò)這些離子或分子將吸收的能量傳遞給生物大分子而使其電離。,基質(zhì)輔助激光解吸離子化原理,基質(zhì)輔助激光解吸離子化特點(diǎn),①基質(zhì)輔助激光解吸離子化中，激光的能量大量消耗于晶格擾動(dòng)中，并不是直接作用與生物大分子使之裂解，因此是一種非常溫和的離子化方式；

27、 ②激光采用N2激光源，波長(zhǎng)為337nm，為脈沖式工作方式； ③基質(zhì)輔助激光解吸電離源與飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀所構(gòu)成的質(zhì)譜儀，得到的質(zhì)譜信息主要是分子離子、準(zhǔn)分子離子，而碎片離子和多電荷離子較少。,基質(zhì)輔助激光解吸電離源的關(guān)鍵是使用基質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)軟電離，基質(zhì)的具體作用：從激光束吸收激光能量并轉(zhuǎn)變?yōu)槟巯嗟募ぐl(fā)能；基質(zhì)包圍樣品分子，使之相互隔離，限制聚集體的形成，避免聚集體大分子對(duì)解吸和分析的影響；促進(jìn)樣品分子的離子

28、化過(guò)程。,基質(zhì)輔助激光解吸電離源的基質(zhì)種類很多，對(duì)于不同的分析對(duì)象應(yīng)選擇不同的基質(zhì)，否則對(duì)分析結(jié)果影響很大?；|(zhì)必須滿足一些共性：在合適溶劑中具有良好的溶解性；對(duì)激光具有良好的吸收性能，以使能量在基 質(zhì)中積累；合適的反應(yīng)活性。,常用基質(zhì),基質(zhì)輔助激光電離源的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)質(zhì)量數(shù)可達(dá)300,000Da；10-15 至10-18級(jí)靈敏度；軟電離方式，無(wú)或極少碎片離子；耐鹽（樣品含鹽可達(dá)毫摩爾濃度）；適于分析復(fù)雜混合物。,缺

29、點(diǎn)分辨率低；1000Da以下基質(zhì)峰干擾；激光解吸附離子化有可能使樣品光降解；不能分析非共價(jià)鍵相互作用；定量時(shí)需要內(nèi)校準(zhǔn)；如沒(méi)有反射飛行裝置，不能分析多肽修飾。,4. 質(zhì)量分析器,質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器位于離子源和檢測(cè)器之間，依據(jù)不同的方式將樣品離子按質(zhì)荷比分開。離子通過(guò)分析器后，按不同質(zhì)荷比(m/z)分開，將相同的m/z離子聚焦在一起。 質(zhì)量分析器的類型：,(1)磁分析器(2)四極桿分析器(3)離子阱(4)

30、飛行時(shí)間分析器(5)傅立葉變換離子回旋共振分析器,(1)磁分析器,磁分析器依據(jù)不同質(zhì)量的離子在磁場(chǎng)中有不同的運(yùn)動(dòng)行為，從而將離子分開。主要有兩種形式單聚焦分析器和雙聚焦分析器。,單聚焦分析器只有一個(gè)磁場(chǎng)，當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度和加速電場(chǎng)的電壓不變時(shí)，離子運(yùn)動(dòng)的軌道半徑僅僅取決于離子本身的質(zhì)荷比(m／z)。因此，具有不同質(zhì)荷比的離子，由于運(yùn)動(dòng)半徑的不同而被分析器分開。 缺點(diǎn)是分辨率較低，設(shè)計(jì)良好的單聚焦分析器的分辨率可達(dá)5000。它只適

31、、化學(xué)電離源。合于離子能量分散較小的離子源，如電子轟擊源,單聚焦分析器,雙聚焦分析器,在單聚焦分析器中，離子源產(chǎn)生的離子在進(jìn)入加速電場(chǎng)之前，其初始能量并不為零，且各不相同。若具有相同的質(zhì)荷比的離子，其初始能量存在差異，在通過(guò)分析器后，是不能完全聚焦在一起。為了解決離子能量分散的問(wèn)題，提高分辨率，可采用雙聚焦分析器。所謂雙聚焦，是指同時(shí)實(shí)現(xiàn)方向聚焦和能量聚焦。,雙聚焦分析器除了磁場(chǎng)外，還有一個(gè)靜電場(chǎng)，具有質(zhì)量色散和能量色散，能夠?qū)崿F(xiàn)方向聚

32、焦。,(2)四極分析器,由四根截面為雙曲面或圓形的棒狀電極組成，兩組電極間施加一定的直流電壓和頻率為射頻范圍的交流電壓。,四極質(zhì)量分析器的工作原理與扇形磁場(chǎng)是不同的。扇形磁場(chǎng)靠離子動(dòng)量的差別而把不同質(zhì)荷比的離子分開，而四極質(zhì)量分析器則是靠質(zhì)荷比不同把離子分開。四極質(zhì)量分析器又稱四極濾質(zhì)器。當(dāng)離子束進(jìn)入筒形電極所包圍的空間后，離子作橫向擺動(dòng)，在一定的直流電壓、交流電壓和頻率，以及一定的尺寸等條件下，只有某一種（或某一范圍）質(zhì)荷比的離子能夠

33、到達(dá)收集器并發(fā)出信號(hào)（稱共振離子），其它離子在運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中撞擊在筒形電極上而被“過(guò)濾”掉，最后被真空泵抽走（稱為非共振離子）。,因此，四極場(chǎng)只允許一種具有適當(dāng)穩(wěn)定振幅質(zhì)荷比的離子通過(guò)。四個(gè)電極上的交流和直流電壓從零到一最大值同步增加，可使不同質(zhì)荷比的離子依次分離，按順序通過(guò)四極場(chǎng)實(shí)現(xiàn)質(zhì)量掃描。其掃描范圍可由交流和直流的電壓來(lái)調(diào)節(jié)。如果使交流電壓的頻率不變而連續(xù)地改變直流和交流電壓的大?。ǖ３炙鼈兊谋壤蛔?，電壓掃描），或保持電壓不變

34、而連續(xù)地改變交流電壓的頻率（頻率掃描），就可使不同質(zhì)荷比的離子依次到達(dá)收集器而得到質(zhì)譜圖。,優(yōu)點(diǎn)：①分辨率較高；②分析速度極快，滿質(zhì)量范圍掃描一般只需幾毫秒；③制作工藝簡(jiǎn)單，儀器緊湊，最適合與氣相色譜和高效液相色譜儀聯(lián)用。缺點(diǎn)：①質(zhì)量測(cè)量上限為2000～4000Da；②準(zhǔn)確度和精密度低于磁偏轉(zhuǎn)型質(zhì)量分析器。,四極質(zhì)量分析器的優(yōu)缺點(diǎn),離子阱分析器近幾年開始作為一種簡(jiǎn)易的質(zhì)譜儀而出現(xiàn)的，一般與毛細(xì)管氣相色譜儀聯(lián)用。它的離子源與質(zhì)

35、量分析器同處一室。由色譜儀流出的組分直接送入兼作離子源和分析器的阱內(nèi)。,(3)離子阱,離子阱的特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)小巧，質(zhì)量輕，靈敏度高，而且還有多級(jí)質(zhì)譜功能，它可以用于 GC-MS，也可以用于 LC-MS。,離子阱的主體是一個(gè)環(huán)電極和上下兩個(gè)端蓋電極，環(huán)電極和上下兩端蓋電極都是繞 z軸旋轉(zhuǎn)的雙曲面，直流電壓 U 和射頻電壓 V加在環(huán)電極和端蓋電極之間。,離子阱構(gòu)造,飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（time of flight analyzer）的主要部分是

36、一個(gè)離子漂移管。樣品受到陰極燈絲發(fā)出的電子轟擊后變成離子，柵極G1上的負(fù)脈沖將離子引出離子室，G1，G2間的直流電壓差使離子受到加速并進(jìn)入無(wú)場(chǎng)漂移管，最終按m／z值不同先后到達(dá)離子接收極。,(4)飛行時(shí)間分析器,1-電離室；2-電子接收極；3-陰極；4-離子接收極,,根據(jù)離子運(yùn)動(dòng)動(dòng)能與電場(chǎng)勢(shì)能的關(guān)系式：,可以推導(dǎo)為：,離子以速度ν進(jìn)入漂移區(qū)，假定離子在漂移區(qū)飛行的時(shí)間為 T，漂移區(qū)長(zhǎng)度為 L，則可得：,因此，離子在漂移管中飛行的時(shí)間與離

37、子質(zhì)量的平方根成正比。對(duì)于能量相同的離子，離子的質(zhì)量越大，達(dá)到接收器所用的時(shí)間越長(zhǎng)，質(zhì)量越小，所用時(shí)間越短。根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子分開。,飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的特點(diǎn)是質(zhì)量范圍寬，掃描速度快，既不需要電場(chǎng)，也不需要磁場(chǎng)。但是，存在分辨率低這一缺點(diǎn)。,造成分辨率低的主要原因在于離子進(jìn)入漂移管前的時(shí)間分散、空間分散和能量分散。這樣，即使是質(zhì)量相同的離子，由于產(chǎn)生時(shí)間的先后不同，產(chǎn)生空間位置不同和初始動(dòng)能的不同，達(dá)到檢測(cè)器的時(shí)間就不相

38、同，因而降低了分辨率。,目前，采用離子延遲引出技術(shù)和離子反射技術(shù)，可以在很大程度上克服上述3個(gè)原因造成的分辨率下降。,通過(guò)離子反射技術(shù)，質(zhì)量相同能量不同的離子進(jìn)入反射器后，能量大的離子速度快，但走的距離遠(yuǎn)，能量小的離子速度慢，但走的距離近，經(jīng)過(guò)反射后，二者同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器，這樣就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。,1-離子源；2-檢測(cè)器；3-反射器,離子不是直線飛行，而是在中途被反射后再到達(dá)檢測(cè)器。這種方法有兩點(diǎn)好處:

39、 ①系統(tǒng)具有 “雙聚焦”功能，相同質(zhì)量不同能量的離子被反射后能同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器； ②離子的飛行路程增加了一倍。兩者均有助于提高儀器的分辨率。 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的分辨率可達(dá) 20000 以上，最高可檢質(zhì)量超過(guò) 300 000Da，并且具有很高的靈敏度。,(5)傅立葉變換離子回旋共振分析器,傅里葉變換離子回旋共振分析器（Fourier transform ion cyclotron resonance anal

40、yzer，F(xiàn)TICR）是在原來(lái)回旋共振分析器的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。假定質(zhì)荷比為 m /z的離子進(jìn)入磁感應(yīng)強(qiáng)度為 B 的磁場(chǎng)中，由于受磁場(chǎng)力的作用，離子做圓周運(yùn)動(dòng)（半徑 R），如果沒(méi)有能量的損失和增加，圓周運(yùn)動(dòng)的離心力和磁場(chǎng)力相平衡，可得到：,,為離子運(yùn)動(dòng)的回旋頻率（單位為弧度 /秒）,可以看出，離子的回旋頻率與離子的質(zhì)荷比成線性關(guān)系，當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度固定后，只需精確測(cè)得離子的共振頻率，就能準(zhǔn)確地得到離子的質(zhì)量。 測(cè)定離子共振頻率

41、的辦法是外加一個(gè)射頻輻射，如果外加射頻頻率等于離子共振頻率，離子就會(huì)吸收外加輻射能量而改變圓周運(yùn)動(dòng)的軌道，作螺旋加速運(yùn)動(dòng)，離子收集器放在適當(dāng)?shù)奈恢镁湍苁盏焦舱耠x子。改變輻射頻率，就可以接收到不同的離子。,普通的回旋共振分析器掃描速度很慢，靈敏度低，分辨率也很差。傅里葉變換離子回旋共振分析器采用了線性調(diào)頻脈沖來(lái)激發(fā)離子，即在很短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速頻率掃描，使很寬范圍分布的質(zhì)荷比離子幾乎同時(shí)受到激發(fā)，因而掃描速度和靈敏度比普通回旋共振分析器高

42、得多。,傅里葉變換離子回旋共振分析器示意圖,質(zhì)量分析室是一個(gè)立方體結(jié)構(gòu)，由 3 對(duì)相互垂直的平行板電極組成，置于高真空和由超導(dǎo)磁體產(chǎn)生的強(qiáng)磁場(chǎng)中。,第一對(duì)電極為捕集極，它與磁場(chǎng)方向垂直，電極上加有適當(dāng)正電壓，其目的是延長(zhǎng)離子在室內(nèi)的滯留時(shí)間；第二對(duì)電極為發(fā)射極，用于發(fā)射射頻脈沖；第三對(duì)電極為接收極，用來(lái)接收離子產(chǎn)生的信號(hào)。,樣品離子引入分析室后，在強(qiáng)磁場(chǎng)作用下被迫以很小的軌道半徑做回旋運(yùn)動(dòng)，由于離子都是以隨機(jī)的方式運(yùn)動(dòng)，因此不產(chǎn)生可

43、檢出的信號(hào)。如果在發(fā)射極上施加一個(gè)很快的掃頻電壓，當(dāng)射頻頻率和某離子的回旋頻率一致時(shí)，共振條件得到滿足。離子吸收射頻能量，軌道半徑逐漸增大，變成螺旋運(yùn)動(dòng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的相互作用和能量傳遞，所有離子都做共振運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生可被檢出的信號(hào)。,共振運(yùn)動(dòng)的正離子運(yùn)動(dòng)至靠近接收極的一個(gè)極板時(shí)，吸收此極板表面的電子，當(dāng)其繼續(xù)運(yùn)動(dòng)到另一極板時(shí)，又會(huì)吸引另一極板表面的電子。這樣便會(huì)感生出所謂的“相電流”。相電流是一種正弦形式的時(shí)間域信號(hào)，正弦波的頻率和離子的

44、固有回旋頻率相同，其振幅則與分析室中該質(zhì)量的離子數(shù)目成正比。,如果分析室中各種質(zhì)量的離子都滿足共振條件，那么，實(shí)際測(cè)得的信號(hào)是同一時(shí)間內(nèi)做共振軌道運(yùn)動(dòng)的各種離子所對(duì)應(yīng)的正弦波信號(hào)的疊加。將測(cè)得的時(shí)間域信號(hào)重復(fù)累加，放大并經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換后輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行快速傅里葉變換，便可檢出各種頻率成分，然后利用頻率和質(zhì)量的已知關(guān)系，便可得到常見的質(zhì)譜圖。,FT-MS 有很多明顯的優(yōu)點(diǎn)：①分辨率極高，商品儀器的分辨可超過(guò)106。②分析靈敏度高，且在高靈敏

45、度下可以得到高分辨率。③具有多級(jí)質(zhì)譜功能。④可以和任何離子源相連，拓展了儀器功能。⑤掃描速度快，性能穩(wěn)定可靠，質(zhì)量范圍寬。 當(dāng)然，F(xiàn)T-MS 由于需要很高的超導(dǎo)磁場(chǎng)，因而需要液氦，儀器售價(jià)和運(yùn)行費(fèi)用都比較貴。,幾種質(zhì)量分析器優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比,5. 檢測(cè)與記錄,電子倍增器是現(xiàn)代質(zhì)譜儀廣泛使用的檢測(cè)裝置。一般具有10～20個(gè)電極（鈹銅合金或其他材料）。,檢測(cè),從質(zhì)量分析器射出的具有一定能量的離子，打在第一極上并產(chǎn)生較多的二次

46、電子，這些電子打在第三極上又產(chǎn)生數(shù)量更多的三次電子，在每一極上都重復(fù)這一過(guò)程。這樣經(jīng)過(guò)多極使電子不斷倍增，最后被檢測(cè)。 電子倍增器響應(yīng)快，靈敏度高。隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，電極會(huì)老化，增益會(huì)降低，具有一定的壽命。,信號(hào)增益與倍增器電壓有關(guān)，提高倍增器電壓可以提高靈敏度，但同時(shí)會(huì)降低倍增器的壽命，因此，應(yīng)該在保證儀器靈敏度的情況下，采用盡量低的倍增器電壓。由倍增器出來(lái)的電信號(hào)被送入計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存，這些信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后可以得到色譜

47、圖、質(zhì)譜圖及其他各種信息。 質(zhì)譜儀常用的檢測(cè)器還有閃爍檢測(cè)器、法拉第杯和照相底板等。,光電轉(zhuǎn)換倍增器（閃爍計(jì)數(shù)器）電子發(fā)射撞擊熒光屏，熒光屏發(fā)射光子由光子放大器檢測(cè)。光子放大器密封在容器中，光子可穿過(guò)密封玻璃，避免表面污染，壽命為5年。,記錄,現(xiàn)代質(zhì)譜儀一般都配有高性能計(jì)算機(jī)，應(yīng)用功能強(qiáng)大的操作軟件，設(shè)置儀器工作參數(shù)，采集和處理數(shù)據(jù)，打印出報(bào)告。,第三節(jié) 生物質(zhì)譜的應(yīng)用,生物質(zhì)譜主要用于解決兩個(gè)生物大分子的分析問(wèn)題：其

48、一是精確測(cè)定生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸和糖類等的分子量，并提供它們的分子結(jié)構(gòu)信息；其二是對(duì)存在于生命復(fù)雜體系中的相互作用。 生物質(zhì)譜的應(yīng)用主要包括： 一、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽研究中的應(yīng)用 二、生物質(zhì)譜在多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用 三、生物質(zhì)譜在核酸分析中的應(yīng)用,一、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽研究中的應(yīng)用,,1.相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定2.肽譜測(cè)定3.肽序列測(cè)定4.蛋白質(zhì)翻譯后修飾5.蛋白質(zhì)組分定量分析

49、6.蛋白質(zhì)相互作用研究,,相對(duì)分子質(zhì)量是蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖與多糖的最基本的物理參數(shù)之一，是蛋白質(zhì)、多肽識(shí)別與鑒定中首先要測(cè)定的參數(shù)，也是基因工程產(chǎn)品申報(bào)新藥的重要數(shù)據(jù)之一。相對(duì)分子質(zhì)量正確與否代表著所測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)正確與否，或者意味著一種新的蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。 生物質(zhì)譜可測(cè)定分子質(zhì)量高達(dá)400kDa的生物大分子，準(zhǔn)確度高達(dá)0.001%～0.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳或高效凝膠色譜技術(shù)。,1.相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)

50、定,2.肽譜測(cè)定,肽譜：是蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)化學(xué)裂解或酶解后所獲得的多肽混合物的圖譜。肽譜分析結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸分析、序列分析所得到綜合信息是鑒定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段。 通過(guò)質(zhì)譜獲得的肽譜又稱為肽質(zhì)量指紋圖譜，它是將蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后得到的肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析，給出全部肽段的準(zhǔn)確質(zhì)量，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的快速鑒別和高通量篩選，也成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必不可少的重要技術(shù)手段。,肽譜鑒定流程,樣品,,酶解,酶解片

51、斷,,一級(jí)質(zhì)譜,,PMF肽指紋圖譜,,串聯(lián)質(zhì)譜,對(duì)庫(kù)檢索,,,序列數(shù)據(jù)庫(kù),成功鑒定,,PSMs及后篩選,,序列分析,,未知蛋白,胰蛋白酶酶解,采用含乙腈的脫色液脫色至膠塊變?yōu)榘咨婵崭稍飪x中冷凍干燥胰蛋白酶酶解過(guò)夜采用含TFA和乙腈的溶液溶進(jìn)行肽提取真空干燥采用含TFA和乙腈的溶液溶解樣品并點(diǎn)樣進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)試,質(zhì)譜分析,MALDI-TOF/TOF 4800 質(zhì)譜儀先用MS反射模式得到一級(jí)圖譜一級(jí)質(zhì)譜激光掃描次數(shù): 800

52、次選擇5-10個(gè)母離子做MS/MS分析二級(jí)MS/MS激光掃描次數(shù): 2000次，碰撞能量1KV,數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,采用GPS Explore (V3.6 ，ABI) 軟件進(jìn)行分析使用MASCOT（V2.1, Matrix Science, London, U.K）搜庫(kù)軟件對(duì)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr，切割的酶為trypsin ，允許最大的未被酶切位點(diǎn)數(shù)為1, 可變修飾為半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化，沒(méi)有固定修飾，母離

53、子質(zhì)量容差為50 ppm，片段離子質(zhì)量容差為0.25Da,肽指紋圖譜鑒定,PMF（Peptide Mass Fingerprinting）是根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜（MS）所測(cè)酶解片段的精確分子質(zhì)量鑒定蛋白質(zhì)的一種方法 一般采用MALDI-TOF進(jìn)行鑒定。因?yàn)镸ALDI質(zhì)譜圖中的離子一般只帶一個(gè)電荷，比較容易計(jì)算其原理就是利用了蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的多肽質(zhì)量的信息與實(shí)際測(cè)得的質(zhì)量信息進(jìn)行對(duì)比而實(shí)現(xiàn)鑒定,優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 一級(jí)質(zhì)譜鑒定蛋白

54、質(zhì)的經(jīng)典方法，算法簡(jiǎn)單，速度快缺點(diǎn)： 質(zhì)量相近的多肽增加匹配難度 無(wú)法實(shí)現(xiàn)混合蛋白的鑒定,二級(jí)質(zhì)譜鑒定,質(zhì)譜儀選擇一級(jí)質(zhì)譜中的一個(gè)峰，讓這些峰所代表的離子高速撞擊質(zhì)譜儀中的惰性氣體，使其肽鍵斷裂，并對(duì)庫(kù)搜索鑒定蛋白質(zhì)常用MALDI-TOF／TOF儀器進(jìn)行,優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 鑒定準(zhǔn)確度更高，可以得到蛋白的序列 可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白的鑒定缺點(diǎn)： 增加了一步操作 算法更復(fù)雜，而且需要更多的操

55、作經(jīng)驗(yàn),串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果——質(zhì)譜圖,從一級(jí)質(zhì)譜圖里選出部分峰做二級(jí)質(zhì)譜,一級(jí)質(zhì)譜圖,二級(jí)質(zhì)譜圖,3.肽序列測(cè)定技術(shù),肽序列測(cè)定技術(shù),C端酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，靈敏度低。,質(zhì)譜法：靈敏度高，準(zhǔn)確性好，易操作，具有普適性。,,N端化學(xué)降解法：用探針試劑氨基酸苯異硫氰酸酯與游離氨基作用，再用各種層析技術(shù)分離；測(cè)序速度慢，樣品用量大、純度要求高。,串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可直接用于肽序列測(cè)定，通過(guò)采用不同的質(zhì)譜技術(shù)選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，并對(duì)

56、其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，通過(guò)推斷肽片的斷裂，可將肽序列導(dǎo)出。通常在低能氣相碰撞的條件下，肽離子碎片沿著骨架在酞胺鍵處斷裂，產(chǎn)生一個(gè)序列離子階梯。通過(guò)減掉相鄰序列離子的質(zhì)量，由一種或兩種離子系列可推測(cè)出氨基酸的序列。,4.蛋白質(zhì)翻譯后修飾,大多數(shù)生物所表達(dá)的蛋白質(zhì)需經(jīng)過(guò)一系列的翻譯后加工和修飾才能形成最終復(fù)雜的功能執(zhí)行體，所以蛋白質(zhì)的翻譯后修飾成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要方面。 蛋白質(zhì)的修飾類型主要有磷酸化、糖基化等。蛋白質(zhì)磷酸

57、化的分析最令人關(guān)注，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的所有過(guò)程。,蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究最近也有報(bào)道，主要是利用蛋白質(zhì)組結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)核素標(biāo)記研究N-糖基化蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)修飾的研究一般采用二維電泳-免疫印跡-質(zhì)譜技術(shù)，即用親和技術(shù)提取修飾肽段，并用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定修飾肽段來(lái)研究蛋白質(zhì)磷酸化或糖基化。,質(zhì)譜確定蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)的方法：,①用磷酸酯酶處理和MALDI-TOF-MS-PMF相結(jié)合找出混合肽段中哪一個(gè)肽段被

58、磷酸化了;②采用三級(jí)四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜的前體離子掃描技術(shù)進(jìn)行檢測(cè);③用傅立葉變換離子回旋質(zhì)譜的電子捕獲解離技術(shù)鑒定肽片段的磷酸化位點(diǎn)。,5. 蛋白質(zhì)組分定量分析,為了在質(zhì)譜分析中實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量，1999年引入了核素編碼親和標(biāo)簽(ICTA)技術(shù)。 ICTA是一種人工合成的化學(xué)試劑，其結(jié)構(gòu)包括專一的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)（與蛋白質(zhì)的半胱氨酸反應(yīng)）、核素標(biāo)記的連接子和親核反應(yīng)基團(tuán)。分別用不同的ICTA標(biāo)記不同的蛋白，再進(jìn)行等量混合、胰酶消化、親

59、合層析和在線LC-MS/MS分析，就能找到表達(dá)差異的蛋白，并用MS/MS鑒定出是何種蛋白。最近又發(fā)展了新一代的標(biāo)記試劑，在連接子和親和反應(yīng)基團(tuán)之間增加了一個(gè)酶解位點(diǎn)，這樣使裂解后核素標(biāo)簽的分子量減小。,6.蛋白質(zhì)相互作用研究,大部分蛋白質(zhì)的功能執(zhí)行是通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此，蛋白質(zhì)相互作用成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要組成部分。 質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的研究主要有兩種策略： ①首先通過(guò)生化的方法純化

60、蛋白質(zhì)復(fù)合體，然后用質(zhì)譜鑒定其組分。 ②將混合蛋白質(zhì)直接酶解，用多維色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。,二、生物質(zhì)譜在多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,多糖是醛糖和(或)酮糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起的天然聚合物，它可參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，具有多種生物學(xué)功能。然而并不是所有的多糖都具有活性，多糖的活性在很大程度上是由它的結(jié)構(gòu)決定的，因此對(duì)于糖結(jié)構(gòu)的研究，無(wú)論是對(duì)高活性糖的尋求和開發(fā)，還是對(duì)糖生物學(xué)中構(gòu)效關(guān)系的探索與研究，都具有至關(guān)重要的意義。,質(zhì)譜技術(shù)于20世

61、紀(jì)50年代末開始用于糖的分析，它可以提供相對(duì)分子質(zhì)量、多糖的單糖組成、糖苷鍵的連接方式以及分支狀況等多種信息，在糖類的分析中發(fā)揮著不可替代的作用。近年來(lái)，各種軟電離技術(shù)相繼誕生, 使質(zhì)譜技術(shù)在糖生物學(xué)的研究中取得了很大的進(jìn)展。主要包括以下應(yīng)用：1.相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定2.寡糖結(jié)構(gòu)分析3.寡糖序列分析,1.相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定,化學(xué)電離質(zhì)譜傳遞的能量較少而容易得到準(zhǔn)分子離子峰。在多糖分析中常用的反應(yīng)氣有異丁烷和氨氣。如以NH3為反應(yīng)氣體就能

62、給出[M+NH4]+作為基峰，從而很容易推導(dǎo)出相對(duì)分子質(zhì)量。 快原子轟擊質(zhì)譜，通過(guò)正離子方式增加一個(gè)質(zhì)子或陽(yáng)離子、也可通過(guò)負(fù)離子方式失去一個(gè)質(zhì)子產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子作為譜圖的主要信號(hào)，并給出反映連接順序等信息的碎片。因此，可用來(lái)測(cè)定寡糖鏈的相對(duì)分子質(zhì)量，同時(shí)還可以根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算出寡糖的聚合度。,2.寡糖結(jié)構(gòu)分析,GC-MS可以提供有關(guān)寡糖殘基類型、鏈的連接方式、糖的序列和糖環(huán)形式、聚合度等多種結(jié)構(gòu)信息。多糖為大分子物質(zhì)，

63、不能直接揮發(fā),因而須將多糖降解為結(jié)構(gòu)單糖或寡糖，并且將其衍生成具有易揮發(fā), 對(duì)熱穩(wěn)定的衍生物。在應(yīng)用GC-MS進(jìn)行多糖的結(jié)構(gòu)分析時(shí)，通常先將樣品進(jìn)行甲基化保護(hù)羥基，然后以完全酸水解，進(jìn)而進(jìn)行乙酰化得到揮發(fā)性乙?；苌?，再進(jìn)行GC-MS分析。,3.寡糖序列分析,基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜不僅可用于多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，還可提供詳細(xì)的寡糖及糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，此外，在多糖的序列分析中具有潛在的優(yōu)勢(shì)。將糖蛋白經(jīng)一系列的酶解，在結(jié)合MALDI

64、-MS可以分析出寡糖的連接順序，進(jìn)行其序列分析。,三、生物質(zhì)譜在核酸分析中的應(yīng)用,核酸是與蛋白質(zhì)相似的一種生物大分子，其構(gòu)成單位不是氨基酸而是核苷酸。目前生物質(zhì)譜在核酸分析方面的應(yīng)用是落后于蛋白質(zhì)和多肽分析中的應(yīng)用。主要是由以下原因： (1)核酸分子帶有磷酸基，極性和電負(fù)性大，容易吸收大量的堿金屬離子，如K+、Na+等，使核酸形成多種分子量的堿性離子加合物，導(dǎo)致離子速度空間和能量的分散，引起核酸分子離子峰變寬，不易準(zhǔn)確

65、測(cè)定其質(zhì)量數(shù);,(2)在基質(zhì)輔助激光解吸電離過(guò)程中，由于核酸分子中所含的堿基具有較強(qiáng)的紫外吸收能力，核酸分子在離子化過(guò)程中易于碎裂; 但由于生物質(zhì)譜本身所擁有的優(yōu)點(diǎn)及技術(shù)的不斷更新和完善，生物質(zhì)譜已經(jīng)在核酸領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。主要有： 1.寡核苷酸片段分析 2.對(duì)與寡核苷酸形成的非共價(jià)復(fù)合物分析,1.寡核苷酸片段分析,已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用紫外一基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析500

66、-600個(gè)堿基的核酸片斷；應(yīng)用紅外-基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析約2180個(gè)堿基的核酸片斷。但由于大核酸分子在離子化的過(guò)程中容易裂解，因此所獲得譜圖的分辨率和準(zhǔn)確度很低，不能反映準(zhǔn)確的分子量信息。目前生物質(zhì)譜對(duì)核酸的分析主要集中于對(duì)小片段(特別是50個(gè)堿基以下)的寡核苷酸片段分析，以便獲得高的分辨率和準(zhǔn)確度。,質(zhì)譜在寡核苷酸分析中的應(yīng)用主要包括:(1)單核苷酸多態(tài)性分型；(2)對(duì)短的串聯(lián)重復(fù)序列；(3) 對(duì)寡核苷酸片段的序列分析。

67、,質(zhì)譜用于寡核苷酸的序列分析通常有三種方法:(1)用質(zhì)譜代替凝膠電泳，分析雙脫氧法合成的混合寡核苷酸片段；(2)分別用磷酸二脂酶 (從5’到3’端和從3’到5’端)切割寡核苷酸片段，用質(zhì)譜分析不同時(shí)間點(diǎn)的酶切溶液，從而得到寡核苷酸的序列信息；(3)應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜直接分析寡核苷酸的序列；,2.對(duì)與寡核苷酸形成的非共價(jià)復(fù)合物分析,目前多ESI-MS采用研究生物大分子間或生物大分子與其它配體分子間形成的非共價(jià)復(fù)合物。這是因?yàn)镋SI-MS用的

68、是迄今最軟的“電離源”，離子化過(guò)程不會(huì)對(duì)非共價(jià)復(fù)合物有較大的影響。而對(duì)于MALDI-ESI-MS，分析過(guò)程首先需要生物分子與基質(zhì)形成共結(jié)晶，才能使其離子化，而所用的基質(zhì)大部分都是有機(jī)酸，可能導(dǎo)致生物分子變性從而影響非共價(jià)復(fù)合物的形成。,(l)準(zhǔn)確。檢測(cè)對(duì)象是生物大分子本身所特有一個(gè)物理性質(zhì)—分子量，而其他方法是通過(guò)一種間接的方式來(lái)表征生物大分子，有時(shí)還要受到其他條件的影響，如電泳，其結(jié)果是要受到生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響;,質(zhì)譜法用于生物