細菌的分類與鑒定實驗室技術(shù)發(fā)展

1、,細菌分類鑒定的實驗室技術(shù)發(fā)展,（一）細菌分類鑒定的指標,1.傳統(tǒng)指標2.分子生物學指標,1.生物分類的傳統(tǒng)指標,形態(tài)特征群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等；個體：細胞形態(tài)，染色反應，各種特殊構(gòu)造等。,從不同層次，用不同學科的技術(shù)方法來研究和比較不同微生物的細胞、細胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類群特征的資料。,生理生化反應營養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長因子等；酶：產(chǎn)酶種類和反應特性等；代謝產(chǎn)物：

2、種類，產(chǎn)量，顯色反應等。,生態(tài)特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等；生活史特點：在生活史中出現(xiàn)的菌體變化特點及其規(guī)律性；血清學反應：利用抗原構(gòu)造上的差別進行鑒定；噬菌體的敏感性；其他,2.生物分類的分子生物學指標,DNARNA,,按照標準進行傳統(tǒng)的生化反應鑒定,標準化成品鑒定產(chǎn)品（如：API試劑條）,半自動細菌鑒定儀（如：ATB Expression）,,色譜、光譜分析技術(shù),分子生物學技術(shù),1.生理生化檢測

3、技術(shù)2.色譜、光譜分析技術(shù)3.分子生物學技術(shù),（二）細菌分類鑒定的實驗室技術(shù),人工鑒定,培養(yǎng)基的微量化、標準化和商品化,數(shù)碼分類鑒定技術(shù)（生化反應的數(shù)字化）,自動化鑒定技術(shù)（生物信息的電腦化）細菌的鑒定和藥敏試驗都實現(xiàn)了自動化,,,,1.生理生化檢測技術(shù),前期準備,增菌,劃線分離,染色鏡檢,血清,手工細菌鑒定,手工鑒定流程,1） 臨床常見菌的初步分群雙岐索引鑒定 例如：葡萄球菌屬雙岐索引鑒定,早在七十

4、年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細菌的新方法。這些技術(shù)的應用，為醫(yī)學微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學的細菌鑒定程序，大大提高了細菌鑒定的準確性。 目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得到普遍應用，并早已商品化和形成獨特的不同細菌鑒定系統(tǒng)。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統(tǒng)。這種鑒定系統(tǒng)是自動化鑒定系統(tǒng)的基礎。,2）數(shù)碼鑒定法,數(shù)碼鑒定是指通過數(shù)學的編碼技術(shù)將細菌的

5、生化反應模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學模式，給每種細菌的反應模式賦予一組數(shù)碼,建立數(shù)據(jù)庫或編成檢索本。通過對未知菌進行有關(guān)生化試驗并將生化反應結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字（編碼），查閱檢索本或數(shù)據(jù)庫，得到細菌名稱。 其基本原理是計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應出現(xiàn)的頻率總和。,數(shù)碼鑒定法基本原理,微量生化反應系統(tǒng)Micro-ID系統(tǒng),— + — — + + + — — — + +

6、 + — —,0 2 0 0 2 1 4 0 0 0 2 1 4 0 0,,,,,,2 3 4 3 4,相加所得數(shù)字：23434 查出相應細菌為：大腸埃希菌,項目分值,數(shù)

7、碼鑒定法基本原理,先將細菌分離純化。 做染色形態(tài)觀察、氧化酶、糖發(fā)酵試驗。 根據(jù)染色、氧化酶、糖發(fā)酵試驗結(jié)果選擇不同的生化反應板進行接種（同一個鑒定系統(tǒng)，配有不同細菌的生化反應板）。 培養(yǎng)后，讀取生化反應結(jié)果，得到一組數(shù)據(jù)。 將這組數(shù)據(jù)查編碼本（即數(shù)據(jù)庫），即得到鑒定結(jié)果。,實驗方法：,數(shù)碼鑒定法基本原理,3）自動化的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統(tǒng),細菌數(shù)碼分類技術(shù)是細菌自動化鑒定技術(shù)的基礎，細菌鑒定自動化

8、是把生化反應數(shù)字化技術(shù)進一步電腦化，數(shù)據(jù)庫用電腦管理，結(jié)果用電腦分析和鑒定。 鑒定系統(tǒng)的工作原理因不同的儀器和系統(tǒng)而異。不同的細菌對底物的反應不同是生化反應鑒定細菌的基礎，而試驗結(jié)果的準確度取決于鑒定系統(tǒng)配套培養(yǎng)基的制備方法、培養(yǎng)物濃度、孵育條件和結(jié)果判定等。 大多鑒定系統(tǒng)采用細菌分解底物后反應液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測定揮發(fā)或不揮發(fā)酸，或識別是否生長等方法來分析鑒定細菌。,對標本同時進行鑒定

9、與藥敏測試,全自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng),,檢測流程,純培養(yǎng)新鮮平板上挑取菌落,制成標準濁度（0.5~0.6麥氏單位）的菌懸液,菌液加入肉湯中，倒入檢測板，上機檢測。,檢測流程,,掃描板條，輸入資料，等待鑒定結(jié)果。,檢測流程,,挑選菌落,樣品制備于樣品盤上,菌種鑒定結(jié)果,MALDI BioTyper軟件-數(shù)據(jù)庫分析,獲取質(zhì)譜指紋信號,以蛋白為基礎的分析方法(Protein based approach),1.樣品制備,2.質(zhì)譜信號,

10、3.菌種鑒定,2.質(zhì)譜分析的細菌鑒定流程,直接涂抹法 (Direct Transfer ),單一菌種 (Pure culture),涂抹單一菌落于樣品盤上(Single colony on MALDI )Target,加上 1 ml 基質(zhì)溶液(Overlay with 1 ml HCCA Matrix),,,90-95% 以上的常規(guī)樣品可于此制備法得到鑒定結(jié)果,步驟 1：樣品制備,質(zhì)譜圖:多數(shù)為核糖體蛋白(ribosomal pr

11、oteins) 信號,大腸桿菌 (E.coli),步驟 2：采集譜圖,Calculation of a matching score based on:Rel Score% matches of the reference spectrum(e.g. 6 / 10 = 0.6)Rel P-Num.% matches of the unknown spectrum(e.g. 6 / 20 = 0.3)I-Corr

12、.value of intensity correlation,Unknown microorganism is matched against each Main spectrum in biotyper library. Ranking according to matching score, threshold for ID,MSP: Main Spectrum Peaks,步驟 3：數(shù)據(jù)庫比對,,Result Report

13、 | Detected Species | Ranking |act Sc |max Sc |Rel Score |PN k |PN b |PN m |Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

14、--------------Spectrum #12 | Ps. mendocina DSM50017 | 1 | 3813 | 4271 | 0.89 | 41 | 10 | 83 | 0.55 | 0.88 | 438 | Ps. oleovorans B396 | 2 | 1671 | 3450 | 0.48 | 1

15、4 | 8 | 83 | 0.22 | 0.39 | 41 | Ps. fluoreszens B340 | 3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19 | 4 | Ps. veronii DSM11331 | 4 |

16、 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 | 3 | Ps. putida DSM291 | 5 | 374 | 2821 | 0.13 | 3 | 3 | 83 | 0.05 | 0.12 | 1 | Ps. puti

17、da B401 | 6 | 329 | 2638 | 0.12 | 3 | 2 | 83 | 0.05 | 0.11 | 1,譜圖模式比對進行細菌鑒定,,,微生物鑒定得分及含義,25,MALDI Biotyper 1 樣品 ~ 5 分鐘96 樣品(整盤) ~ 30 分鐘生化反應測試鑒定法8 小時 – 數(shù)天,Can I identify microorg

18、anisms fast ?,,Acetobacter aceti subsp. acetiAcetobacter pasteurianus subsp.lovaniensisAcetobacter pasteurianus subsp.pasteurianusActinomadura aurantiacaActinomadura libanoticaActinomadura lividaAgrobaterium tumefa

19、ciensArthrobacter globiformisArthrobacter oxydansArthrobacter pyridinolisArthrobacter sulfureusBacillus alcalophilusBacillus cohniiBacillus sphaericusBrevibacillus brevisBrevibacterium linensCellulomonas flavig

20、enaCellulomonas turbataCorynebacterium glutamicumComamonas testosteroniiGluconobacter oxydans subsp. oxydansGluconobacter oxydans subsp.oxydansGordonia amaraeGordonia rubropertinctaGordonia terraeHalomonas denit

21、rificansHalomonas elongataHalomonas elongataHalomonas halmophilaHalomonas halmophilaHydrogenophaga flavaHydrogenophaga pseudoflava,Methylobacterium mesophilicumMethylobacterium organophilumMethylobacterium radiot

22、oleransMethylobacterium rhodesianumParacoccus versutusParacoccus versutusPseudomonas balearicaPseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescensPseudomonas oleovoransPseudomonas putidaPseudomonas stutzeriPseudonoca

23、rdia hydrocarbonoxydansRhizobium leguminosarumRhodococcus coprophilusRhodococcus fasciansRhodococcus globerulusRhodococcus rhodniiRhodococcus rhodochrousRhodococcus ruberSinorhizobium melilotiStarkaya novellaSt

24、arkaya novellaStreptomyces albusStreptomyces avidiniiStreptomyces azureusStreptomyces badiusStreptomyces griseusStreptomyces hirsutusStreptomyces lavendulaeStreptomyces phaeochromogenesStreptomyces violaceoruber