動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)5免疫缺陷動(dòng)物

1、第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫特點(diǎn)第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫基因系統(tǒng)第三節(jié) 免疫缺陷動(dòng)物的分類第四節(jié) T淋巴細(xì)胞缺陷動(dòng)物第五節(jié) 聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物第六節(jié) 其它免疫缺陷動(dòng)物,第九章 免疫缺陷動(dòng)物,第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫特點(diǎn),免疫系統(tǒng)種系發(fā)生 動(dòng)物 細(xì)胞 淋巴器官 免疫反應(yīng) 分類 名稱 淋巴細(xì)胞 漿細(xì)胞

2、 胸腺 脾臟 細(xì)胞免疫 體液免疫 IgM IgG IgA IgE IgD 圓口類 鰻 + - + -

3、 - + - - - - 魚類 油鮫 + - + + - + - - - - 鯉魚 + +

4、 + + - + - - - - 兩棲類 蠑螈 + + + + - + - - - - 青蛙

5、 + + + + + + + - - - 爬行類 龜、蛇 + + + + ？ + + - - - 鳥類 雞

6、 + + + + + + + + - - 哺乳類 鼠、人 + + + + + + + + + + 無脊椎動(dòng)

7、物僅為原始的細(xì)胞吞噬作用,抗體從母體到幼體的傳遞1、存在兩種傳遞方式： ① 出生前在胎盤、卵黃囊或羊膜內(nèi)完成。 ② 出生后從初乳獲得。 動(dòng)物 胎盤類型 轉(zhuǎn)移途徑 抗體轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移時(shí)間

8、出生前 出生后 小鼠 血性絨毛膜 腸（主要） 卵黃囊 + ++ 妊娠到17d 大鼠 血性絨毛膜 腸（主要） 卵黃囊 + ++ 妊娠到20d 豚鼠 血性絨毛膜 卵黃囊（主要）

9、 腸 +++ + 妊娠到2d 兔 血性絨毛膜 卵黃囊 +++ - 妊娠到15d 靈長類 血性絨毛膜 胎盤 +++ -

10、 妊娠到3個(gè)月 犬 內(nèi)皮絨毛膜 腸 - ++ 出生到8d,2、IgE和IgA在母子傳遞中不進(jìn)入體液循環(huán)，IgM只在出生后傳遞。3、大、小鼠、豚鼠、兔、猴，幼仔血清中母源抗體效價(jià)高于母體。4、大、小鼠、犬、貓、兔、猴，從妊娠期抗體開始向胎兒移行，更多以母乳轉(zhuǎn)移

11、。,一、小鼠能誘發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng),全身性過敏反應(yīng)表現(xiàn)為循環(huán)性虛脫，動(dòng)物幾小時(shí)內(nèi)死亡。小鼠IgE、IgG能使皮膚致敏，引起真皮過敏反應(yīng)。近交系小鼠的免疫反應(yīng)多由常染色體上的免疫反應(yīng)( immune response , Ir )基因控制，Ir基因與H-2(主要組織相容性位點(diǎn))相連接，與T細(xì)胞功能密切相關(guān)。 Ir基因具有常染色體顯性特征，定位于MHC區(qū)域，它決定一個(gè)特定氨基酸聚合體是否能引起抗體的產(chǎn)生。 每一Ir基因編碼一個(gè)MH

12、C分子的一個(gè)特定等位形式。,二、大鼠①蠕蟲感染能誘發(fā)大量IgE抗體，但常規(guī)免疫只能使大鼠產(chǎn)生少量，且體內(nèi)存在時(shí)間較短。②大鼠對(duì)炎癥反應(yīng)敏感，特別是踝關(guān)節(jié)。但遺傳背景、機(jī)體免疫狀態(tài)可影響發(fā)病率。,三、豚鼠①豚鼠用于結(jié)核菌素的皮內(nèi)試驗(yàn)和接觸過敏物質(zhì)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，但與人有差別。②豚鼠有兩種變態(tài)反應(yīng)抗體：IgG1和IgG2。③13系和2系遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力不同。④13系和2系對(duì)特異性抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不同。,四、兔

13、①兔用于制備高效價(jià)、特異性強(qiáng)的免疫血清，但因品種、個(gè)體不同而產(chǎn)生不同效價(jià)的抗體。②IgM增強(qiáng)IgE的形成，IgG抑制IgE的生成。IgE與IgG引起過敏反應(yīng)征狀相似。③腸道淋巴組織由派伊爾氏淋巴集結(jié)、圓囊和闌尾構(gòu)成。,五、犬①在犬花粉病和蠕蟲感染中，由IgE介導(dǎo)。②新生犬初次免疫抗體全為IgM，再次免疫能產(chǎn)生與成年犬相同的IgM、IgG。③Beagle犬的循環(huán)T淋巴細(xì)胞對(duì)PHA的反應(yīng)隨年齡而變化，高峰在6Ws-6W

14、s。,六、豬①初乳中主要為IgG，其次為IgA。②豬IgA與人有交叉反應(yīng)。③腸道固有層含有分泌IgA的漿細(xì)胞。,七、羊①初乳與常乳中主要免疫球蛋白為IG1。②山羊是制備IG的良好動(dòng)物。③綿羊紅細(xì)胞用于補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。,八、猴①新大陸猴無IgA。②舊大陸猴有IgE。③新大陸狨猴有免疫耐受。,第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫基因系統(tǒng),一、小鼠移植抗原 George Snell采用近交系，通過分析移植

15、腫瘤和其他組織的排斥反應(yīng)首先發(fā)現(xiàn)H-2。 20年后，Baruj Benacerraf提出不同近交系對(duì)簡單多肽抗原的應(yīng)答中產(chǎn)生抗體，控制這類免疫應(yīng)答的基因稱為Ir基因（immune response gene）該基因定位于MHC區(qū)域，,1、小鼠H-2符號(hào)表示 近交系小鼠H-2等位基因采用小寫字母。 與小鼠移植排斥反應(yīng)有關(guān)的兩個(gè)最重要的H-2基因座是H-2K和H-2D。 K基因

16、首先發(fā)現(xiàn)于MHC標(biāo)示為k的種系；D基因發(fā)現(xiàn)于MHC標(biāo)示為d的種系。故在k型MHC的種系中，其k等位基因被稱為Kk，亦簡稱為H-2k；而在MHC為d的種系中被稱為Kd，亦簡稱為H-2d。 K、D、L三個(gè)位點(diǎn)均為MHC的I類基因。,2、小鼠H-2抗原的分布密度①脾臟為最高；②其次為肝、淋巴結(jié)、胸腺；③再次，以肺、腎上腺、腎臟的順序遞減。,3、近交系和雜交小鼠異體移植的一般規(guī)律,由此可見，MHC基因產(chǎn)物是基因共顯性表達(dá)的結(jié)果

17、。,三、小鼠單倍型1、MHC單倍型① 單倍型指染色體上的一組可以共同一道遺傳的MHC等位基因。② 不同的重組株在H-2內(nèi)的一些基因位點(diǎn)具有不同的等位基因，即H-2單體型不同。 ③ H-2單倍型不同，免疫反應(yīng)有明顯差異。④ 所有雜合子個(gè)體均有兩個(gè)MHC單倍型，近交系小鼠只有一個(gè)單倍型。,常用近交系小鼠H-2復(fù)合體的單倍型,2、MHC重組體①在MHC系統(tǒng)中可發(fā)生基因重組。 ②重組體等位基因的命名可按產(chǎn)生重組體的原始近交系小

18、鼠而定。 ③選用不同單倍體小鼠，對(duì)特定抗原應(yīng)答性反應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)小鼠有類似針對(duì)合成分枝多肽(T,G)-A-L抗原的基因(Ir-1)與MHC存在著連鎖關(guān)系,H-2重組體的單倍型,第三節(jié) 免疫缺陷動(dòng)物的分類,免疫缺陷動(dòng)物（immunodeficient animal）: 指由于先天性遺傳突變或用人工方法造成一種或多種免疫免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動(dòng)物。先天性免疫缺陷動(dòng)物：T淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：裸小鼠（nude m

19、ice）、裸大鼠(nude rat)。B淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：性連鎖免疫缺陷小鼠（CBA/N）。NK淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：Beige小鼠。聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物：嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID mice)、蟲蛙小鼠(motheaten mice)。其它免疫缺陷動(dòng)物：顯性半肢畸形小鼠(dominant hemimelia mice)。,獲得性免疫缺陷動(dòng)物：小鼠AIDS模型：SCID小鼠AIDS模型、AIDS的轉(zhuǎn)基因小鼠。猴AIDS模

20、型：反轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)、SIV誘發(fā)。有蹄動(dòng)物慢病毒感染。黑猩猩HIV感染。,第四節(jié) T淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物,一、 裸小鼠（nude mice）： 即先天性無胸腺裸小鼠，由11號(hào)染色體上nu隱性基因突變導(dǎo)致。 該基因已回交到不同品系，包括：NIH-nu/nu、BALB/c-nu/nu 、C3H-nu/nu 、C57BL/6-nu/nu。 被毛生長異常，呈裸體外表。無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常胸腺

21、上皮，不能使T-cell正常分化，導(dǎo)致細(xì)胞免疫力低下。幼齡鼠有殘存的未分化的上皮細(xì)胞。,B細(xì)胞功能正常，NK細(xì)胞活力增強(qiáng)。繁育能力差，乳腺發(fā)育缺損，以雄性純合子與雌性雜合子繁育。T細(xì)胞缺陷可通過移植成熟T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或正常胸腺上皮得到校正。,二、裸大鼠(nude rat)： 基因符號(hào)為rnu，一般特征似裸小鼠。發(fā)育遲緩，體重為正常大鼠的70%。裸大鼠較裸小鼠對(duì)多種傳染病更敏感。比裸小鼠更強(qiáng)壯、

22、壽命更長。體型較大，對(duì)大范圍的外科手術(shù)方法較有利。,,三、裸鼠的腫瘤學(xué)特性1. 人類腫瘤的裸鼠移植人癌組織（手術(shù)標(biāo)本）移植：手術(shù)標(biāo)本移植成功率28.3%，其中復(fù)發(fā)性腫瘤50%，轉(zhuǎn)移性腫瘤38.5%，原發(fā)瘤20.5%。黑色素瘤和結(jié)腸癌移植成功率最高，乳腺和淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤成功率低。女性生殖系統(tǒng)腫瘤和結(jié)腸癌生長最快，胚胎性和骨的腫瘤生長慢。腫瘤細(xì)胞株移植：腫瘤細(xì)胞株移植成功率高于人癌手術(shù)標(biāo)本。,2. 宿主和腫

23、瘤特性對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響裸鼠遺傳背景：裸鼠遺傳背景對(duì)腫瘤生長有一定影響。移植部位和途徑：皮下移植易于觀察腫瘤生長狀況，部位多在背部靠頭部皮下，或腋下（因其血管豐富，利于腫瘤生長，且不影響動(dòng)物的活動(dòng)）。移植部位和途徑可影響移植瘤的生物學(xué)特性：皮下接種一般不發(fā)生腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移；腹腔內(nèi)接種則顯示癌細(xì)胞惡性行為。,人為改變裸鼠免疫功能：采用免疫抑制、放射照射可提高移植瘤成功率，包括難以移植成功的腫瘤。人類腫瘤細(xì)胞的本身特

24、征：分化程度低移植成功率高，惡性程度與移植成功率呈正相關(guān)。激素和宿主性別的影響：激素依賴性腫瘤，如乳腺癌、子宮、肺及骨的腫瘤，在裸鼠中最難成功。裸鼠的性別和激素水平直接影響裸鼠移植瘤。,3. 裸鼠移植瘤組織學(xué)特征及穩(wěn)定性人癌在裸鼠體內(nèi)形成移植瘤后，仍保留原發(fā)腫瘤的一般特點(diǎn)。如：病理組織結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、染色體特征、腫瘤標(biāo)記物等。部分人類腫瘤移植后，表現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)腫瘤細(xì)胞亞群的選擇性生長，造成起源于同一原發(fā)瘤的細(xì)胞在生

25、物學(xué)性狀表現(xiàn)一定的異質(zhì)性；且出現(xiàn)于裸鼠移植中的腫瘤細(xì)胞亞群也不一定都能在人體原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)。,4. 宿主對(duì)移植瘤的反應(yīng)和間質(zhì)改變惡性腫瘤作為細(xì)胞懸液或組織塊移植到宿主裸鼠,宿主與腫瘤相互作用，間質(zhì)反應(yīng)隨之發(fā)生，由宿主產(chǎn)生新的移植瘤間質(zhì)，如血管床、纖維架。間質(zhì)改變引起癌細(xì)胞分化程度的差異，分化程度改變多發(fā)生于裸鼠第一次傳代。,5. 移植瘤的轉(zhuǎn)移腫瘤分化程度：腫瘤分化程度越低，浸潤轉(zhuǎn)移越明顯，轉(zhuǎn)移發(fā)生越早。接種途徑與部位

26、：腹腔接種一般轉(zhuǎn)移率高于皮下，常位接種轉(zhuǎn)移更接近于原腫瘤在人體內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況。環(huán)境因素：SPF環(huán)境中帶瘤裸鼠淋巴結(jié)比普通環(huán)境轉(zhuǎn)移率高、轉(zhuǎn)移快。宿主狀態(tài)：遺傳背景、周齡、飼養(yǎng)條件及免疫狀態(tài)直接影響腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。,第五節(jié) 聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物,一、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID mice) 1983年由美國Fox chase癌癥中心于C.B-17Icr近交系中發(fā)現(xiàn)，突變基因scid位于16號(hào)染色體。

27、該突變基因造成編碼Ig重鏈和TCR的基因重排異常，抑制B-cell和T-cell前體的正常分化。C.B-17Icr為攜帶來自C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重鏈Igh-1b等位基因的 BALB/cAnIcr的同源近交系。,純合子血清中無免疫球蛋白，淋巴結(jié)、胸腺變小，缺乏體液、細(xì)胞免疫功能。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中。SCID小鼠的滲漏現(xiàn)象。在嚴(yán)格的SPF環(huán)境中，SCID小鼠可存活1年以上,二、scid-hu小鼠

28、 通過移植人免疫組織或免疫細(xì)胞，可使SCID小鼠具有人類部分免疫系統(tǒng)，稱為SCID-hu小鼠。1. SCID-hu免疫重建的機(jī)制:SCID小鼠體內(nèi)T、B細(xì)胞自身不能分化成特異性淋巴細(xì)胞，但小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞分化的微環(huán)境正常，能接受人體正常組織的移植成為嵌合體小鼠。1988年Mosier首次將人外周血淋巴細(xì)胞及人胎肝移植于SCID小鼠的皮下和腎包膜下獲得免疫重建的成功。,目前已有人胚胎組織如骨髓、胸腺、肝、淋巴結(jié)，成年人外

29、周血淋巴細(xì)胞、骨髓、脾進(jìn)行移植。由于成年人外周血淋巴細(xì)胞比人胚胎組織、脾更易獲得，PBL-hu-SCID模型研究更多。PBL-hu-SCID小鼠脾檢出的人淋巴細(xì)胞達(dá)80-90%，移植6個(gè)月后，80%小鼠可從外周血中檢出人淋巴細(xì)胞。,2. SCID-hu存在的問題:重建成功率達(dá)不到100%，不同實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果以及同一實(shí)驗(yàn)室不同小鼠個(gè)體間免疫重建的程度存在明顯差異。SCID小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞的功能不能標(biāo)準(zhǔn)化。不同類型淋巴

30、細(xì)胞組成的移植物移植于SCID小鼠，T細(xì)胞易獲得免疫重建，活性B細(xì)胞數(shù)目有限。易發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)導(dǎo)致小鼠死亡。免疫重建方法不盡統(tǒng)一，效果不同，影響該模型的標(biāo)準(zhǔn)化及重復(fù)性。,三、蟲蛙小鼠(motheaten mice) 1965年發(fā)現(xiàn)于C57BL/6J的突變，突變基因me位于第6號(hào)染色體，壽命不超過8周。出生后2天內(nèi)出現(xiàn)皮膚膿腫，有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷。對(duì)胸腺依賴和非依賴抗原均無反應(yīng)。對(duì)T

31、、B細(xì)胞分裂素的增殖反應(yīng)嚴(yán)重受損。細(xì)胞毒細(xì)胞和NK細(xì)胞活性低。伴有自身免疫的傾向，免疫復(fù)合物沉積于腎、肺、皮膚。C57BL/6J-me在1-2日齡表皮可見嗜中性白細(xì)胞集聚，表皮色素呈斑點(diǎn)狀，故稱蟲蛙小鼠。,第六節(jié) 其他免疫缺陷動(dòng)物,一、性連鎖免疫缺陷小鼠 起源于CBA/N，毛色為野鼠色，B細(xì)胞功能缺乏，基因符號(hào)xid，位于X染色體。雌性純合子與雄性雜合子對(duì)胸腺非依賴性抗原（如葡聚糖、肺

32、炎球菌脂多糖、DNA）沒有體液免疫。 B細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞分裂素缺乏反應(yīng)，分泌IgM和IgG的B細(xì)胞減少， IgM和IgG含量降低，但T細(xì)胞功能正常。移植正常鼠骨髓到xid宿主，B細(xì)胞缺損可以恢復(fù)。該小鼠用于研究B細(xì)胞的發(fā)生、功能、異質(zhì)性。,二、bg/bg小鼠(beige mice) NK細(xì)胞功能缺陷突變小鼠，bg是13號(hào)染色體上的隱性基因。由于細(xì)胞溶解作用的識(shí)別過程受損，導(dǎo)致NK細(xì)胞功能缺乏。

33、純合bg基因還損傷細(xì)胞毒T細(xì)胞功能，降低粒細(xì)胞趨化性和殺菌活性，延遲巨噬細(xì)胞抗腫瘤殺傷作用。影響溶酶體發(fā)生，導(dǎo)致溶酶體膜缺損，溶酶體增大。溶酶體功能缺陷導(dǎo)致bg小鼠對(duì)化膿性細(xì)菌敏感，必須飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中?？捎糜谘芯可厝狈σ赘行栽龈呔C合征。,三、顯性半肢畸形小鼠(dominant hemimelia mice) Dh(dominant hemimelia )是顯性突變基因，位于1號(hào)染色體。出生后，后趾畸形即多趾或少