生技劉治敏畢業(yè)論文

1、1重組重組木聚糖酶木聚糖酶XynAHJ3XynAHJ3的酶學性質(zhì)研究的酶學性質(zhì)研究姓名姓名:劉治敏劉治敏專業(yè)專業(yè):生物技術生物技術指導教師指導教師:李俊俊李俊俊摘要摘要：本文主要介紹重組木聚糖酶XynAHJ3的酶學性質(zhì)以及應用。結果表明：該木聚糖酶XynAHJ3的最適反應溫度為70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；60℃下XynAHJ3的半衰期60min，70℃下很快失活；酶反應最適反應pH為6.0，在pH12.0時仍具有25%以上的

2、酶活；經(jīng)pH4.0–11.0的緩沖液處理1h，酶活剩余90%以上；10mM的Ag和Hg2可完全抑制XynAHJ3；Fe3、Cu2、Mn2、Pb2及10%（vv）乙醇對XynAHJ3的抑制較強；Zn2、Co2及Fe2對XynAHJ3的抑制較弱（剩余酶活60%）；βmercaptoethanol可使XynAHJ3的酶活提高~0.3倍；其余金屬離子和化學試劑對XynAHJ3的影響很小，10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。關鍵

3、詞關鍵詞：木聚糖酶；酶學性質(zhì)；酶活前言：言：木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物細胞中主要的半纖維素成分。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。一個木聚糖分子的完全酶解需要幾步酶促反應，其中作用于主鏈的酶有兩種：β1，4木聚糖酶和β木糖苷酶。一般而言，前者從主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，將木聚糖分解成低聚木糖，而后者則作用于低聚木糖的末端，釋放出木糖[1]。對木聚糖酶的研究早在60年代就已開始，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類

4、型不同性質(zhì)的木聚糖酶[2]。木聚糖酶的酶學性質(zhì)決定了其在應用上的潛力及應用領域，一般要求木聚糖酶有較高的催化效率、較好的抗逆性、較廣的pH和溫度適應范圍等。近年來，大量有關木聚糖酶結構與功能的研究不斷展開一方面加深了對木聚糖酶作用的分子機理的了解另一方面為通過基因工程和蛋白質(zhì)工程改良木聚糖酶的性質(zhì)、研制出符合不同應用領域要求的木聚糖酶產(chǎn)品提供了指導?，F(xiàn)在已知能夠產(chǎn)生木聚糖酶的菌種包括細菌、真菌、黑曲酶、木霉等，不同來源的木聚糖酶的催化特

5、性是有差異的有不同的最適pH和最適作用溫度，金屬離子對不同來源的木聚糖酶活性的影響各不相同[345]。從產(chǎn)木聚糖酶的菌種的篩選，目的基因的提取以及轉入大腸桿菌中表達，用IPTG誘導產(chǎn)酶，酶的提純，最后進行酶學性質(zhì)的測定，其一序列的流程目的是為了獲得木聚糖酶的高產(chǎn)菌株，有望應用于食品及飼料等產(chǎn)業(yè)，為更好的服務社會。對實驗室木聚糖酶XynAHJ3整個獲取流程有一定的了解，本文重點是對其3(6)振蕩器(7)pH儀(8)分光光度計(9)移液槍，

6、錐形瓶，容量瓶，試管若干2實驗方法實驗方法2.12.1重組木聚糖酶組木聚糖酶XynAHJ3XynAHJ3酶活力測定酶活力測定木聚糖酶在一定條件（pH7.0，37℃)下，催化水解底物木聚糖生成木糖等還原糖，還原糖又同DNS試劑發(fā)生顯色反應，用分光光度計測定其吸光度，計算酶活力。酶活力單位定義：在37℃pH7.0條件下，每mL待測酶液每min催化底物生成1μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。(1)木糖標準曲線的繪制分別吸取l0mm

7、ol／ml木糖標準液0、25、50、100、150、200μl，放于六只帶塞的磨口試管中，用pH7.0檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液補充至1.0ml入DNS試劑1.5ml，于100℃沸水浴中準確煮沸5min，取出后立即放入冷水浴中冷卻至室溫，冷卻后于分光光度計上測得OD540以空白管做對照調(diào)零。以OD540數(shù)值為橫坐標，對應的木糖含量(μmol)為縱坐標繪制標準曲線[6]。(2)木聚糖酶活力測定的具體方法酶活性測定方法采用DNS法[7]：將底物

8、溶于0.1M緩沖液中，使其終濃度為0.5%（wv）；反應體系含100μL適量酶液，900μL底物；底物在37℃預熱5min后，加入酶液后準確反應10min，然后加1.5mLDNS終止反應，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長下測定OD值?？瞻捉M先加1.5mLDNS終止反應，再補加100μL酶液，其他步驟條件與實驗完全一樣。1個酶活單位（U）定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量。2.22.2重組木聚糖酶重

9、組木聚糖酶XynAHJ3XynAHJ3的最適的最適pHpH和pHpH穩(wěn)定性的測定方法穩(wěn)定性的測定方法（1）酶的最適pH測定：分別用不同pH的緩沖液配制底物，用實驗室純化的木聚糖酶XynAHJ3在37℃和pH4.0–12.0的緩沖液下進行酶促反應，按照標準方法測定酶活。（2）酶的pH穩(wěn)定性測定：將純化的酶液加入pH3.0–12.0的0.1M緩沖液中，混勻后，在37℃下處理1h，然后在37℃下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為：