畢業(yè)論文實(shí)驗步驟精

1、5.1.1實(shí)驗過程5.1.1.1SMGABSA抗原的制備5.1.1.1.1SM與BSA的初始比對偶聯(lián)效果的影響1、pH9.6的碳酸鹽緩沖液的配制；稱取碳酸鈉10.2g及碳酸氫鈉16.8g溶于雙蒸水中定容至6000ml；4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?、稱取五組200mgBSA分別溶于50mlpH9.6的碳酸鹽緩沖液中，獲得A、B、C、D、E溶液；3、分別稱取50mg、100mg、200mg、400mg、800mg鏈霉素，并將其分別溶于50mlpH9

2、.6的碳酸鹽緩沖液中，獲得a、b、c、d、e溶液；4、將Aa、Bb、Cc、Dd、Ee混合，再分別向五組中緩慢加入0.2mL25%的戊二醛，邊加邊攪拌。；5、將加入戊二醛后的五組溶液置于室溫下攪拌反應(yīng)6h；6、0.01molL、pH7.4PBS緩沖液的配制；稱取8.0gNaCl、0.1gKCl、2.9gNa2HPO412H2O和0.2gKH2PO4加雙蒸水溶解，定容至1000mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?、反應(yīng)完后用pH7.4的PBS緩沖液透

3、析1d；8、透析完后對每組進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，看偶聯(lián)是否成功；9、將鏈霉素，BSA、五個組的偶聯(lián)抗原用碳酸鹽緩沖稀釋成一定濃度，用碳酸鹽緩沖液作對照，進(jìn)行紫外掃描；10、根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算偶聯(lián)比，確定鏈霉素與BSA的最佳初始量x。5.1.1.1.2戊二醛的量對偶聯(lián)效果的影響1、稱取五組鏈霉素與BSA（第一組實(shí)驗的最佳初始量x）分別溶于碳酸鹽緩沖液中，獲得A′、B′、C′、D′、E′溶液；2、向每組分別緩慢加入0.1mL、0.2

4、mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL25%戊二醛，邊加邊攪拌，獲得a′、b′、c′、d′、e′溶液，將其置于室溫下攪拌反應(yīng)6h；3、反應(yīng)完后用pH7.4的PBS緩沖液透析1d；4、透析完后對每組進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，看偶聯(lián)是否成功；5、將鏈霉素，BSA、五個組的偶聯(lián)抗原用碳酸鹽緩沖稀釋成一定濃度，用碳酸鹽緩沖液作對照，進(jìn)行紫外掃描；6、根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算偶聯(lián)比，確定戊二醛的最佳加入量y。5.1.1.1.3偶聯(lián)時間對偶聯(lián)效果的

5、影響1、稱取五組一定質(zhì)量的鏈霉素、BSA（第一組實(shí)驗的最佳初始量x），并將其溶于100mL的碳酸鹽緩沖液中；2、分別向五個組中加入一定量的戊二醛（第二組實(shí)驗的最佳加入量y），邊加邊攪拌；3、將五個組置于室溫下，分別攪拌反應(yīng)2h、4h、6h、8h、10h；4、待每組反應(yīng)完后，用pH7.4PBS緩沖液透析1d；5、透析完后對每組進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，看偶聯(lián)是否成功；6、將鏈霉素，BSA、五個組的偶聯(lián)抗原用碳酸鹽緩沖稀釋成一定濃度，用碳

6、酸鹽緩沖液作對照，進(jìn)行紫外掃描；7、根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算偶聯(lián)比，確定最佳反應(yīng)時間t。5.1.1.2鏈霉素GAOVA包被原的制備其方法與SMGABSA抗原的制備相同。5.1.1.3根據(jù)以上三組實(shí)驗，利用正交法分析出鏈霉素在用戊二醛合成抗原時的最優(yōu)條件1、根據(jù)上述三組實(shí)驗的x，y，t對應(yīng)分別設(shè)置三個變量；2、對鏈霉素與戊二醛的初始比變量進(jìn)行設(shè)置，x1、x、x1；堆積膠經(jīng)常使用5%的濃度，還是以兩塊量為例，成分如下：蒸餾水2.3mlA液0.6

7、7mlC液1ml10%過硫酸銨30ulTEMED5ul按以下步驟操作：A.將A液、C液和蒸餾水在三角瓶中混勻B.加入過硫酸銨和TEMED并輕輕攪拌使其混勻C.將堆積膠加到分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端D.將梳子插入凝膠內(nèi)，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。E.約30min凝膠聚合，聚合后小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。F.將凝膠放入電泳槽中，將電泳緩沖液加到內(nèi)外電泳槽中，使凝膠的上下端均能

8、浸泡在緩沖液中。③制備樣品和上樣將各種樣品（純化前樣品、過親和柱后樣品、加熱后樣品、0h取樣的樣品、空載質(zhì)粒的樣品）與5ｘ樣品緩沖液在一個Eppendf管中混合，100℃加熱2～10min。稍微離心，將樣品加到樣品孔中。將樣品加到加樣孔的底部，并伴隨著染料水平的升高而升高加樣槍頭，避免帶入氣泡。為了避免邊緣效應(yīng)，在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。④電泳接通電源，將電壓調(diào)至150～200V之間開始電泳，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時即可停

9、止電泳。結(jié)束后從電泳槽中取出玻璃板，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠。采用考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色液：1L考馬斯亮藍(lán)R2501g甲醇450ml蒸餾水450ml冰醋酸100ml染色過程：將膠置于染色液中，振蕩染色0.5～1h有時根據(jù)染色液用過的次數(shù)多少，適當(dāng)延長染色時間。⑥脫色脫色液：1L甲醇100ml冰醋酸100ml蒸餾水800ml棄去染液，將凝膠在水中漂洗幾次，加入脫色液直至背靜干凈，條帶清晰可見。所需藥品與器材：鏈霉素，戊二醛，牛血