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1、細胞培養(yǎng)技術(shù),醫(yī)學細胞生物學實驗,徐志浩 15294858210遺傳與基因工程教研室院系樓西側(cè)一樓2016年,光學顯微鏡技術(shù)、細胞的形態(tài)觀察(1-26)培養(yǎng)細胞的凍存與復蘇 (P80)動物細胞的原代培養(yǎng)(P82)小鼠骨髓染色體標本的制備及觀察(P53)細胞分裂標本的制備及觀察(P65),醫(yī)學細胞生物學實驗,一、實驗目的,了解細胞培養(yǎng)的基本原理。初步掌握細胞原代培養(yǎng)的基本方法。掌握細胞培養(yǎng)過程中無菌操作的方法和注意事項

2、。了解培養(yǎng)中的動物細胞的一般形態(tài)。,醫(yī)學細胞生物學實驗,相關(guān)概念體外培養(yǎng)：是指在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞、組織或器官，并使之生存和生長的一系列操作。,二、實驗原理,醫(yī)學細胞生物學實驗,原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織置于體外進行的首次原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被接種到新的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)培養(yǎng)的過程。,,,細胞培養(yǎng)(cell culture) 組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)。,無機鹽、氨基酸、維生素、糖

3、類等基本物質(zhì),醫(yī)學細胞生物學實驗,細胞培養(yǎng)的條件,,營養(yǎng)物質(zhì),無菌無毒環(huán)境：體外培養(yǎng)首要條件，無菌并及時清除代謝產(chǎn)物。溫度：人和哺乳動物的適宜溫度35-37℃氣體環(huán)境：O2(三羧酸循環(huán))和CO2(5％, 調(diào)節(jié)pH)pH：7.2-7.4弱堿環(huán)境滲透壓：適當?shù)碾x子濃度,環(huán)境,尤其針對附著生長的細胞,,介質(zhì),細胞培養(yǎng)的條件,,無菌環(huán)境溫度氣體環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)pH滲透壓介質(zhì),培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基和培養(yǎng)用液,培養(yǎng)容器,,,醫(yī)學細胞生物學

4、實驗,細胞培養(yǎng)的主要試劑,基礎培養(yǎng)基：RPMI 1640、DMEM 、 MEM等。血清（天然成分）：牛血清最常用、偶有用馬血清?？股兀?00×雙抗母液，青霉素的含量為10KU/ml， 鏈霉素的含量為10mg/ml。消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使細胞脫離組織或容器壁， 用含血清培養(yǎng)液中止其活性 。清洗液：生理鹽水或磷酸緩沖液。,配制各種溶液均需使用高

5、純度的去離子水,培養(yǎng)容器,醫(yī)學細胞生物學實驗,用于防止微生物進入組織、細胞或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作技術(shù)。如外科手術(shù)需防止細菌進入傷口。在各種生物實驗中,為了防止微生物地生長和繁殖影響實驗的進行,也要在無菌的環(huán)境下進行。,無菌操作技術(shù),醫(yī)學細胞生物學實驗,用品滅菌-滅菌技術(shù)操作環(huán)節(jié)保持無菌,滅菌技術(shù),醫(yī)學細胞生物學實驗,滅菌技術(shù),操作方法,適用范圍,設備用品,滅菌液擦拭,滅菌液擦拭,金屬、玻璃、塑料器械，容器外壁。,酒精、升

6、汞等,高溫灼燒,火焰輕微灼燒,耐高溫器械-金屬、玻璃器械用品，玻璃容器瓶口等。,酒精燈等,紫外線滅菌,紫外線照射15-30min,各種用品的簡單滅菌。操作人員遠離。,紫外燈，穿透能力弱,過濾除菌,過濾,有機溶液試劑,過濾裝置和濾膜,高溫高壓滅菌,121℃，壓力15磅(1.05kg/cm)，滅菌15-30 min。,耐高溫高壓玻璃、金屬、塑料器械用品，無機溶液等。,高溫高壓滅菌鍋,醫(yī)學細胞生物學實驗,醫(yī)學細胞生物學實驗,醫(yī)學細胞生物學實驗

7、,醫(yī)學細胞生物學實驗,醫(yī)學細胞生物學實驗,醫(yī)學細胞生物學實驗,,直接或間接接觸細胞的用品要保持無菌。,醫(yī)學細胞生物學實驗,器械用品濃酸浸泡過夜，自來水沖洗10次以上，蒸餾水洗三遍以上完成清洗，高壓滅菌。溶液試劑滅菌。,紫外線照射無菌間、超凈臺、實驗服15-20min通風去除O3 滅菌水擦拭試驗臺。,洗手，酒精棉球擦拭雙手。穿著實驗服。佩戴口罩和頭套。,點燃酒精燈，火焰消毒，火焰周圍操作。材料進出超凈臺密封并重新消毒。防止交

8、叉污染。,,,,超凈工作臺,醫(yī)學細胞生物學實驗,三、實驗內(nèi)容,乳鼠肺組織細胞原代培養(yǎng),醫(yī)學細胞生物學實驗,處死乳鼠（窒息法）→75%酒精消毒2-3s（燒杯中）→轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，解剖取肺（培養(yǎng)皿）→PBS洗滌→初剪→ PBS洗滌→轉(zhuǎn)移到青霉素瓶→ 剪碎→加5-8倍體積胰酶 → 37 ℃消化20min→加1-2ml培養(yǎng)液終止消化→吹打混勻→靜置3-5min→ 取上清轉(zhuǎn)入離心管中→配平→ 1000rpm離心5min（離心機的使用）→棄上清→加

9、5ml培養(yǎng)液→吹打混勻→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶（擰緊蓋子后，松半圈）→放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)→24h后觀察。,三、實驗內(nèi)容,乳鼠肺組織細胞原代培養(yǎng),醫(yī)學細胞生物學實驗,到培養(yǎng)室→洗手→帶帽子和口罩→坐在超凈工作臺旁→酒精棉球擦拭雙手→點燃酒精燈→分發(fā)器材和動物→按步驟操作,肺,肺,,,醫(yī)學細胞生物學實驗,醫(yī)學細胞生物學實驗,,操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)

10、常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，并冷卻后才能夾取組織；所有的操作都應該在超凈工作臺中酒精燈火焰的旁邊進行；吸取不同的液體要換用不同的吸管（防止交叉污染）；操作過程中，動作要敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及器皿的消毒部位；消化和離心時要先加蓋才能拿出去；離心后需用酒精棉擦洗后才開蓋；離心機使用前，對稱的兩個離心管必須配平后才可離心；所有的垃圾、廢液等均放入大燒杯中，保持臺面整潔。,四、本實

11、驗注意事項,可以比較經(jīng)濟地、大量地提供生物性狀相同的細胞作為研究對象。由于細胞處于體外培養(yǎng)環(huán)境中，便于用各種技術(shù)方法研究和觀察細胞結(jié)構(gòu)和功能的變化。由于細胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長期地存活和傳代，因而便于研究和觀察細胞遺傳性的改變。由于人工培養(yǎng)條件易于改變，能嚴格控制并進行單因素分析，所以便于用各種物理的、化學的或生物的外界因素來研究細胞生命活動的規(guī)律。細胞培養(yǎng)是闡述生命現(xiàn)象、發(fā)病機理和篩選藥物的重要手段；是細胞生物學、分子生物學