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1、殺蟲劑離體(in vitro)篩選方法研究進(jìn)展,武漢工程大學(xué)巨修練,,介紹內(nèi)容,一、傳統(tǒng)的農(nóng)藥篩選方法二、殺蟲劑離體篩選方法三、基因水平的殺蟲劑離體篩選方法,傳統(tǒng)的農(nóng)藥篩選方法,殺蟲劑 主要為活體篩選, 明顯的不足是蟲源一致性差、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、受外界條件影響大。 殺菌劑 主要為離體篩選，仍為目前的主要篩選方法。但篩選效率有待于提高。,,,除草劑 主要為活體篩選，仍為目前的主要篩選方法。但

2、篩選重復(fù)性差、周期長(zhǎng)、效率低。,,,,殺蟲劑離體篩選方法,傳統(tǒng)的離體篩選方法 測(cè)定化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制；對(duì)酪氨酸酶的抑制；對(duì)線粒體呼吸酶活性的影響等。2. 基于細(xì)胞水平的殺蟲劑離體篩選 一般選用昆蟲的初孵幼蟲細(xì)胞，然后進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)后，用MTT發(fā)測(cè)定細(xì)胞存活率。,MTT（溴化-[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基]四氮唑）法是二十世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種快速、簡(jiǎn)便的體外抗

3、癌藥物敏感性的測(cè)試方法。目前已被廣泛用于殺蟲劑離體篩選實(shí)驗(yàn)。其作用的基本原理如下：活細(xì)胞線粒體中的琥玻酸脫氫酶能夠還原黃色的溴化MTT為藍(lán)紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情況下與活細(xì)胞數(shù)成正比。由于甲臜的生成量可通過酶標(biāo)儀測(cè)定其在570nm處的吸收度（OD值）而測(cè)定，因此可根據(jù)OD值推測(cè)出活細(xì)胞的比例，測(cè)定化合物的殺蟲活性。,3. 同位素示蹤技術(shù)在殺蟲劑離體中的應(yīng)用,受體—配體結(jié)合分析法是一種靈敏，快速，簡(jiǎn)便

4、，經(jīng)濟(jì)的離體生物活性測(cè)定方法，研究發(fā)現(xiàn)，利用合適的放射性配體作探針，檢測(cè)受體—配體結(jié)合方式及強(qiáng)度，可用于殺蟲劑分子的快速篩選。,配體與受體作用在作用于GABAA受體的殺蟲劑篩選中常用的探針有[3H]EBOB（1-(4’-乙炔基苯基)-4-正丙基-2,6,7-三氧雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷），[3H]Ivermectin B1a,，[35S]TBPB（4-叔丁基-雙環(huán)硫化磷酸酯），作用于煙堿乙酰膽堿受體的[3H]IMI（1-（6-氯-3-吡

5、啶甲基）-N-硝基-咪唑烷-2-亞胺），作用于魚尼汀受體的[3H] Ryanodine等。,[3H]EBOB,操作程序如下：,,抑制率(%) = 100×(A-C)/ (A-B)A：表示總放射量值（dpm）；B：表示非特異性結(jié)合放射量值（dpm）；C：表示待測(cè)樣品放射量值（dpm）。,親和性測(cè)定實(shí)驗(yàn)過程,,一組雙環(huán)硫化磷酸酯類化合物的活性,化合物 （15）,化合物 （17）,LC50rat/LC50housefly =

6、 52 （in vitro）,LD50house = 0.04 mg/fly（in vivo）且表現(xiàn)出較高的殺線蟲活性,化合物活體與離體的活性相關(guān)性,LC50housefly = 0.455 nMLC50rat > 10000 nM,1.電生理技術(shù)在殺蟲劑離體篩選中的應(yīng)用2.熒光檢測(cè)技術(shù)在殺蟲劑離體篩選中的應(yīng)用 3.其它基于不同受體的離體篩選方法,基因水平的殺蟲劑離體篩選方法,電生理技術(shù)在殺蟲劑離體篩選中的應(yīng)用,全細(xì)胞膜

7、通道記錄原理,青蛙卵母細(xì)胞GABA受體電生理測(cè)定過程,化合物4f 抑制GABA受體膜片嵌電生理,GABA 對(duì)其受體的電生理作用,GABAA受體拮抗劑對(duì)GABA受體的電生理作用,熒光檢測(cè)技術(shù)在殺蟲劑離體篩選中的應(yīng)用,鈣離子敏感熒光染料一些離子通道對(duì)鈣離子通透，當(dāng)被激活時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高。因此使用鈣敏感的熒光染料標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鈣離子，實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，可間接檢測(cè)離子通道的活動(dòng)。電壓敏感熒光染料靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜兩側(cè)

8、存在電位差，處于極化狀態(tài)。當(dāng)離子通道活動(dòng)時(shí)，帶電離子通過離子通道，改變膜兩側(cè)的電位差。根據(jù)這一原理，Molecular Devices 推出電壓敏感染料免洗試劑盒。借助檢測(cè)細(xì)胞膜兩側(cè)熒光信號(hào)的變化間接反應(yīng)離子通道的活動(dòng)。,熒光檢測(cè)技術(shù)原理,將細(xì)胞孵育于一定的熒光指示劑和Mask dye 中，熒光指示劑附著于細(xì)胞膜外側(cè)，并為Mask dye 所掩蓋。當(dāng)細(xì)胞膜上的離子通道打開或由其它原因?qū)е录?xì)胞的去極化時(shí)，熒光指示劑移至細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但Mas

9、king dye 不能進(jìn)入細(xì)胞，熒光指示劑的熒光釋放可以檢測(cè)到熒光信號(hào)。,GABA受體拮抗劑活性熒光檢測(cè)程序,,其它基于不同受體的離體篩選方法,基于cAMP水平變化的受體藥物篩選: cAMP是一種非常重要的第二信使，Williams研究發(fā)現(xiàn)通過檢測(cè)cAMP 水平變化，可以反應(yīng)配體對(duì)受體的激動(dòng)或拮抗作用。,基于ATP水平變化的受體藥物篩選: 采用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)ATP，具有更高的敏感性，而且簡(jiǎn)便、快速，是目前最為流行的方法。該方法基于螢火

10、蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）催化熒光素氧化，消耗ATP，發(fā)出光子的高效發(fā)光反應(yīng)，具有發(fā)光效率極高、發(fā)光量與ATP含量呈很好的線性關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)。,隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，特別是功能基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組、細(xì)胞組、組合化學(xué)、組合生物合成等新的研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，使得潛在的藥物作用靶點(diǎn)數(shù)目和有待篩選的化合物數(shù)目顯著增多。這些進(jìn)展為藥物篩選提供了良好的條件，同時(shí)也對(duì)篩選的效率提出了更高的要求，不僅需要更大的篩選規(guī)模和篩選速

11、度，同時(shí)也要求篩選模型的檢測(cè)技術(shù)能夠更快速、全面反映被篩樣品的生物活性。,展望,武漢工程大學(xué)在農(nóng)藥研發(fā)方面的工作,環(huán)氧蟲啉,氟氯吡氧乙酸十二酯,新化合物,（吡蟲啉類似物）,（氟草煙類似物）,仿制品種,除草劑氟酮磺隆(flucarbazone) ; 氟丁酰草胺（beflubufamid）嘧啶肟草醚（Pyribenzoxim); 丙炔氟草胺（flumioxazin); 環(huán)酯草醚（pyriftalid）。 剎蟲劑呋蟲胺(dinote

12、furan) ; 環(huán)蟲酰肼（chromafenozide); 氟啶蟲胺腈(Sulfoxaflor) 新型殺線蟲劑(imicyafos) ; 啶蟲丙醚(Pyridaly)；丁氟螨酯（Cyflumetofen); 聯(lián)苯肼酯(Bifenazate) 。 剎菌劑噻酰菌胺(tiadinil) ; 噻氟菌胺（thifuzamide）；氰霜唑（cyazofamid）;喹螨醚（fenazaquin）； 新型殺線蟲劑（imicyafos） ;