霍亂檢測(cè) ppt課件

1、,弧 菌 屬(Vibrio)侯 玨臨 床 微 免 教 研 室,,,,,,,,,目的與要求1、掌握霍亂弧菌及副溶血弧菌的主要生物學(xué)性狀、微生物鑒定方法2、 熟悉霍亂弧菌及副溶血弧菌致病性,一、概述,弧菌科包括4個(gè)菌屬 弧菌屬 氣單胞菌屬 鄰單胞菌屬 發(fā)光桿菌屬 共性： 革蘭氏染色陰性 氧化酶陽性 發(fā)酵糖類 具有極端單鞭毛

2、,弧菌屬,分布廣泛, 水中最多共36個(gè)種, 引起人類致病的14種 短小弧形, 革蘭陰性菌單鞭毛能發(fā)酵葡萄糖氧化酶陽性對(duì)弧菌抑制劑O/129 （二氨基二異丙基喋啶）敏感鈉離子能刺激其生長(zhǎng),一 霍亂弧菌(Vibrio cholerae),霍亂弧菌是霍亂的病原菌我國《傳染病防治法》: 甲類傳染病國際檢疫的烈性傳染病到目前為止共發(fā)生了七次霍亂世界大流行,,流行情況 1817-1923年 六次大流行

3、 （均從印度恒河三角洲發(fā)源地） 古典生物型1961年 第七次大流行 El Tor生物型1992年 亞洲流行（印度、盂加拉、泰國） O139群,一、生物學(xué)特性,形態(tài)與染色,革蘭氏染色陰性弧型或逗點(diǎn)狀,米泔水樣糞便涂片鏡檢：可見“ 魚群樣排列"單端單鞭毛，無莢膜，無芽胞活菌懸滴鏡檢, 可見“ 穿梭或流星狀運(yùn)動(dòng)”

4、,霍亂弧菌（革蘭染色，1000倍）,Vibrio cholerae with its single polar flagellum.,,營養(yǎng)要求不高，生長(zhǎng)較快兼性厭氧最適生長(zhǎng)溫度： 37℃怕酸嗜堿，最適pH:7.2-7.4 pH:7.4-9.6快速生長(zhǎng),培養(yǎng)特性,,培養(yǎng)特性,選擇性的增菌培養(yǎng)基:堿性蛋白胨水pH8.5 常用的強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基：慶大霉素瓊脂(GTA)pH8.4-8.5四號(hào)

5、瓊脂pH8.4硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板 (TCBS瓊脂)pH8.6常用的弱選擇性培養(yǎng)基：堿性瓊脂pH8.4堿性膽鹽瓊脂pH8.4,,培養(yǎng)特性,菌落特征TCBS瓊脂：形成圓形、微凸、表面光滑 濕潤(rùn)整齊、大黃色菌落慶大霉素培養(yǎng)基：扁平、濕潤(rùn)、半透明菌落中心呈灰褐色血瓊脂上形成的菌落較大，EL Tor生物型可形成β-溶血,,霍亂弧菌培養(yǎng)于TCBS瓊脂（37℃，18小時(shí)）發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸而使菌落呈黃色

6、,,生化反應(yīng),發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）氧化酶（+）,,抗原性,O抗原：耐熱，耐受100 ℃ 2h 特異性高，分群和分型的基礎(chǔ)H抗原：不耐熱，特異性低,抗原性,,根據(jù)O抗原不同: 霍亂弧菌分155個(gè)血清群根據(jù)與O1抗血清凝集與否： O1群 ：與O1抗血清凝集（+） 非 O1群： 與O1抗血清凝集（-）

7、O1群 根據(jù)表型差異： 古典生物型 EL Tor生物型 菌體抗原（A、B、C)不同：小川型(AB) 稻葉型(AC) 彥島型(ABC,,,,血清型：O1群霍亂弧菌的菌體抗原由

8、A、B、C三個(gè)抗原成份組成,,性狀\生物型 古典型 EL TorⅣ組噬菌體裂解 + -Ⅴ組噬菌體裂解 - + 對(duì)多粘菌素B的敏感性 +

9、 -雞RBC凝集 - +羊RBC溶血 - +V-P - +霍亂弧菌兩個(gè)

10、生物型 的鑒別,,,,生物型：根據(jù)表型差異,O1群霍亂弧菌有古典生物型和E1 Tor 生物型之分,,,雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)：在玻片上滴加生理鹽水一滴，取被檢菌18-24h培養(yǎng)物少許在鹽水中制成濃厚菌懸液，然后加一滴2.5％雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻，,1min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性，紅細(xì)胞呈均勻分散者為陰性。El Tor生物型為陽性，古典型為陰性。,分型和分群,（一）、血清學(xué)分群（型） 血清 群 生物型

11、 血清型 古典型 小川型(AB) 稻葉型(AC) 彥島型(ABC) O1群

12、 小川型(AB) El Tor型 稻葉型(AC) 彥島型(ABC) 非 O1群 (O2- 群),,,,,

13、,,,變 異 性,,抵抗力水中存活20天怕酸耐堿慶大霉素耐藥消毒 漂白粉：吐瀉物（1：4）,1hr,二、臨床意義,致病物質(zhì)侵襲力： 鞭毛 菌毛霍亂腸毒素（cholera enterotoxin ,CE),,,,致病機(jī)理,霍亂弧菌,,胃,,對(duì)酸敏感，很快被殺死,,腸,胃酸降低或缺乏，菌體增多,,鞭毛、菌毛、粘液素酶,絨毛上大量繁殖,,CT的B亞單位結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂受體,,形成膜

14、通道,,A1肽鏈進(jìn)入細(xì)胞,,,ATP → cAMP↑,,,大量體液和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔而發(fā)生劇烈吐瀉,,大量脫水和失鹽,發(fā)生代謝性酸中毒，血循環(huán)衰竭，甚至休克或死亡,,激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng),粘膜細(xì)胞分泌亢進(jìn)、Na+、Cl-吸收抑制,二、臨床意義,所致疾病 霍 亂,烈性腸道傳染病我國的法定傳染?。最悾┍憩F(xiàn)為劇烈的上吐下瀉瀉出物呈“米泔水樣”，并含大量弧菌，此為本病典型的特征,微生物學(xué)檢查

15、,標(biāo)本采集糞便（主）肛拭子嘔吐物尸體腸內(nèi)容物 采得的標(biāo)本應(yīng)立即接種于培養(yǎng)基 不能立即檢查的，要放入堿性蛋白胨水或插入Cary- Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中 標(biāo)本與保存液比例約為1∶5,,,檢驗(yàn)程序,標(biāo)本 直接檢查堿胨水增菌培養(yǎng) 直接熒光抗體染色 CT測(cè)定

16、 直接涂片 凝集試驗(yàn) 動(dòng)力及制動(dòng)試驗(yàn)TCBS等分離培養(yǎng) 血清學(xué)鑒定 藥敏試驗(yàn) 初步報(bào)告

17、 生化鑒定、分型 確診報(bào)告,,,,,,,,,,,,,,,,,,,檢驗(yàn)方法一.直接檢查1.直接涂片鏡檢:革蘭氏染色陰性,魚群狀排列的弧菌2.動(dòng)力及制動(dòng)試驗(yàn)動(dòng)力觀察：采取病人“米泔水樣”大便或嘔吐物制成懸滴片，觀察細(xì)菌動(dòng)力，可見流星或穿梭狀動(dòng)力的細(xì)菌。制動(dòng)試驗(yàn)：

18、 標(biāo)本， 霍亂多價(jià)診斷血清（效價(jià)1：64），用暗視野鏡觀 察，3分鐘內(nèi)運(yùn)動(dòng)被抑制的即為陽性 快速而特異操作簡(jiǎn)便，但必須有數(shù)量較多的弧菌才檢出3.直接熒光抗體染色 4. CT測(cè)定,檢驗(yàn)方法二.分離培養(yǎng)：,分離用的培養(yǎng)基有強(qiáng)、弱2種選擇培養(yǎng)基。弱選擇培養(yǎng)基：堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂。強(qiáng)選擇培養(yǎng)基：常用的有慶大霉素瓊脂、4號(hào)瓊脂和

19、TCBS瓊脂等現(xiàn)多采用堿性蛋白胨水增菌，再用強(qiáng)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離。,,檢 驗(yàn) 方 法三. 鑒定 以血清學(xué)（玻片凝集）為主，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)作出判斷1.玻片凝集試驗(yàn):試劑;O1群霍亂弧菌多價(jià)和單價(jià)診斷血清 O139群診斷血清方法:從分離培養(yǎng)基上挑取可疑菌落于霍亂弧菌多價(jià)診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)。診斷血清應(yīng)稀釋成1:32-1:64的效價(jià)使用，立即出現(xiàn)凝集者為陽性，同時(shí)設(shè)生理鹽水和陽性細(xì)菌株對(duì)照,,,,2. 形態(tài)學(xué)

20、檢查 取純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)及染色性 用懸滴法或半固體穿刺法檢測(cè)動(dòng)力,,3. 生化反應(yīng)分解葡萄糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；氧化酶試驗(yàn)（+）吲哚（+）賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）霍亂紅試驗(yàn)（+）粘絲試驗(yàn)（+）O/129敏感試驗(yàn)(+) 耐鹽試驗(yàn): 3%NaCl(+), 6%NaCl(+) 0% NaCl(

21、+), 10% NaCl(-),紅色,硝酸鹽 亞硝酸鹽色氨酸 靛基質(zhì) 濃硫酸,,,,,,,霍 亂 紅 反 應(yīng)（cholera red test）,,,5. 分型鑒定(1) 使用小川型及稻葉型的單價(jià)血清作玻片凝集反應(yīng) 小川型單價(jià)血清凝集 稻葉型單價(jià)血清小川型 + -稻葉型

22、 - +彥島型 + +(2)古典型和埃爾托型的鑒別 我國流行以El Tor、小川型霍亂弧菌為主,,,,,,鑒定依據(jù),1、形態(tài)學(xué) G—弧菌或桿菌，具有活潑動(dòng)力， 制動(dòng)試驗(yàn)陽性；2、培養(yǎng)特點(diǎn)  弧菌選擇培養(yǎng)基上菌落形態(tài)典型；3、血清學(xué) 能與霍亂弧菌診斷血清發(fā)生明顯凝集；

23、4、生化反應(yīng) 分解葡萄糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 氧化酶試驗(yàn)（+），霍亂紅試（+） 粘絲試驗(yàn)（+）, O/129敏感試驗(yàn)(+),報(bào)告方式,1、標(biāo)本直接鏡檢：見形態(tài)典型、運(yùn)動(dòng)活潑、制動(dòng)試驗(yàn)（+），可作初報(bào)。2、若確定為霍亂弧菌時(shí)，可報(bào)告：經(jīng)培養(yǎng)有霍亂弧菌生長(zhǎng)。,,０139型霍亂弧菌O139血清群它是已發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)能引起霍亂流行的非０1群霍亂弧菌目前世界衛(wèi)生組織規(guī)定，霍亂病原菌包括O1群霍亂弧

24、菌與O139群霍亂弧菌與Ｏ1群霍亂弧菌O抗原不同；O22群與O155群有交叉反應(yīng)對(duì)弧菌抑制劑０/129的低濃度和高濃度均具有抗性具有莢膜對(duì)多種抗生素耐藥,副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus,,概述,副溶血弧菌隸屬于弧菌科弧菌屬，是一種具有嗜鹽性的細(xì)菌,需在NaCl濃度較高(3%-4%左右)的環(huán)境中才能生長(zhǎng)繁殖。是沿海地區(qū)食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌。,生物學(xué)性狀,形態(tài)與染色,革蘭陰性菌桿狀

25、無莢膜、無芽胞單鞭毛,培養(yǎng)特性,具有嗜鹽性，氯化鈉的最適濃度為3.5%；增菌培養(yǎng)基: 1%NaCl堿性蛋白胨水或 4%NaCl蛋白胨水TCBS瓊脂: 菌落圓形、隆起、光滑、濕潤(rùn)、不透明， 藍(lán)綠色SS瓊脂： 2-3mm，扁平、無色、半透明、蠟滴狀， 菌落不易挑起我妻瓊脂培養(yǎng)集: β–溶血(神奈川現(xiàn)象，KP),生物學(xué)性狀,,,生物學(xué)性狀,生化反應(yīng)

26、,( 1) 耐鹽試驗(yàn) 3%NaCl(+), 7%NaCl(+) 0% NaCl(-), 10% NaCl(-) (2) 神奈川現(xiàn)象（3) 氧化酶(+) 、蔗糖(-) 吲哚試驗(yàn)(+)、賴氨酸脫羧酶（+） 鳥氨酸脫羧酶（+）,抗原構(gòu)造與血清學(xué)分型,（1） 鞭毛(H)抗原 （2） 菌體(O)抗原 是分群的依

27、據(jù) （3） 表面(K)抗原,生物學(xué)性狀,抵抗力,抵抗力弱不耐冷不耐熱65℃30min即被殺死耐堿怕酸,生物學(xué)性狀,二、臨床意義,1、致病因素: 粘附因子和毒素（1）菌毛（2）毒素 1）耐熱性溶血素 細(xì)胞致死活性 溶血作用

28、 腸毒性作用 心臟毒性 2）耐熱相關(guān)溶血素 2、所致疾病 食物中毒、急性胃腸炎,,,三、微生物學(xué)檢測(cè) 1、標(biāo)本采集 取糞便、肛拭子和可疑食物。2、  檢驗(yàn)程序 標(biāo)本

29、 增菌培養(yǎng)（4%NaCl蛋白胨水）

30、 分離培養(yǎng)(TCBS) 可疑菌落（綠色）

31、 純培養(yǎng)（營養(yǎng)瓊脂） 毒素測(cè)定 鑒定（生化、血清學(xué)檢驗(yàn)）,,,,,,,,,3、檢驗(yàn)方法,（1） 增菌培養(yǎng)：1%NaCl的堿性蛋白胨水

32、 4%NaCl的蛋白胨水 35℃，6-8h;（2） 分離培養(yǎng)：標(biāo)本(增菌培養(yǎng)物) TCBS瓊脂 35℃，18-24 h（3） 鑒定： 嗜鹽性試驗(yàn)：3%NaCl(+), 7%NaCl(+)

33、 0% NaCl(-), 10% NaCl(-) 氧化酶陽性、蔗糖陰性、 賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-） KP(+),,4、鑒定依據(jù)（1）形態(tài)染色特點(diǎn)：G-桿菌具有多形性,懸滴標(biāo)本運(yùn)動(dòng)活潑；（2）培養(yǎng)特點(diǎn)：在選擇平板上菌落形態(tài)典型，TCBS瓊脂 上菌落為藍(lán)綠色；