酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)展

1、酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)展,,何 林,內(nèi) 容,一、免疫分析的發(fā)展歷史二、免疫分析技術(shù)的種類三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史四、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的應(yīng)用五、酶免疫分析技術(shù)的類型六、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的設(shè)備七、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的材料及物品八、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的未來(lái)發(fā)展九、科樂(lè)士全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)的特點(diǎn)十、科樂(lè)士產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣視角與辯點(diǎn),2024/3/12,2,YHLO專業(yè)培訓(xùn),一、免疫分析的發(fā)展歷史,免疫學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史開(kāi)創(chuàng)

2、階段：公元10～18世紀(jì)，天花痘痂預(yù)防開(kāi)花。興起階段：公元18世紀(jì)～20世紀(jì)中葉，牛痘苗預(yù)防天花，發(fā) 現(xiàn)細(xì)菌，建立感染免疫，細(xì)胞免疫和體液免疫學(xué) 說(shuō)，變態(tài)反應(yīng)，免疫化學(xué)。飛躍階段：從1908年埃利希提出側(cè)鏈學(xué)說(shuō)開(kāi)始，對(duì)免記憶、 免疫識(shí)別，免疫耐受、自身免疫、免疫移植等?，F(xiàn)代階段：從1957年開(kāi)始，各種新型免疫分析技術(shù)、免疫學(xué) 說(shuō)、理論、臨床應(yīng)用、疾病診

3、治等取得重大進(jìn)展。,2024/3/12,3,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,根據(jù)所用的技術(shù)和方法，免疫學(xué)的發(fā)展歷史可分為三個(gè)時(shí)期： 一、免疫學(xué)的經(jīng)驗(yàn)時(shí)期（17世紀(jì)-19世紀(jì)） 1.用人痘苗接種預(yù)防天花。（中國(guó)民間） 2.接種牛痘苗預(yù)防天花。 Jenner,免疫發(fā)展歷史中的重要發(fā)現(xiàn)和發(fā)明及人物,,,二、經(jīng)典免疫學(xué)時(shí)期（19世紀(jì)中葉-20世紀(jì)中葉） 免疫學(xué)與微生物學(xué)互相促進(jìn)、共同發(fā)展 * 多種病原菌被發(fā)現(xiàn)； * “

4、病原菌致病”概念的提出； * 疫苗的發(fā)明； * 細(xì)胞吞噬作用的發(fā)現(xiàn)（細(xì)胞免疫）； * 免疫血清具有抵御病原菌的作用（體液免疫）； * 免疫化學(xué)研究取得重大進(jìn)展； * 初步認(rèn)識(shí)多種免疫學(xué)現(xiàn)象的本質(zhì)。,Eli Metchnikoff (1845-1916),Emil von Behring (1845-1917),Robert Koch (1843-1910),Paul Ehrilich (1854-1915)

5、,提出體液免疫理論和抗體生成的側(cè)鏈學(xué)說(shuō),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬作用，提出細(xì)胞免疫理論,發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌；提出病原菌致病的概念,發(fā)現(xiàn)抗毒素并治愈一名白喉患者,實(shí)際上，與此同時(shí)，人們也發(fā)現(xiàn)除了微生物之外的其它物質(zhì)也能引起免疫現(xiàn)象，過(guò)敏現(xiàn)象有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，如血型不符的輸血、器官移植排斥反應(yīng)、血清病等；Koch在發(fā)現(xiàn)了結(jié)核桿菌之后，試圖用注射的方法使動(dòng)物產(chǎn)生免疫，但注射局部卻出現(xiàn)了組織損傷和壞死。,以上事實(shí)揭示出兩個(gè)問(wèn)題： 第一, 免疫不一定僅僅由

6、微生物引起; 第二, 免疫對(duì)機(jī)體不一定總是有利的， 也可以是有害的。 至此，經(jīng)典的免疫概念被動(dòng)搖了，那么，免疫究竟是機(jī)體防御微生物侵襲的特有成分？還是機(jī)體識(shí)別“自己”和“非己”的普遍生物學(xué)現(xiàn)象？這個(gè)問(wèn)題必須有一個(gè)明確的答案。,三.近代免疫學(xué)和現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期（ 20 世紀(jì)中葉—現(xiàn)在）,特異性細(xì)胞的免疫功能、天然和獲得性免疫耐受現(xiàn)象、抗體生成克隆學(xué)說(shuō)、細(xì)胞克隆選擇學(xué)說(shuō)（clonal selection）* Burnet（1

7、957年）提出克隆選擇學(xué)說(shuō)；* 從器官、細(xì)胞和分子水平探討免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能。,MacFarlane Burnet（1899-1985）,克隆選擇學(xué)說(shuō)(clonal selection hypothesis)的基本觀點(diǎn)：,1.機(jī)體內(nèi)存在有能識(shí)別多種抗原的細(xì)胞系（clone），其細(xì)胞表面有識(shí)別抗原的特異性受體（recepter)。 2.抗原進(jìn)入機(jī)體后，選擇具有相應(yīng)受體的免疫細(xì)胞與之結(jié)合，使該細(xì)胞系活化、增殖，并成為抗體產(chǎn)生細(xì)胞和記

8、憶細(xì)胞。 3.若在胚胎期，某抗原選擇相應(yīng)克隆接觸后，該細(xì)胞系就被排除或失去活性，處于抑制狀態(tài)，稱此為禁忌克隆（forbidden clone），使機(jī)體失去針對(duì)該抗原的反應(yīng)性，形成免疫耐受。解釋了天然免疫耐受現(xiàn)象。 4.某些克隆可發(fā)生突變，而與自身組織發(fā)生反應(yīng)，形成自身免疫應(yīng)答。 1960年，Burnet

9、和Medawar獲諾貝爾獎(jiǎng)。,雞法氏囊及哺乳動(dòng)物胸腺的免疫功能的認(rèn)識(shí)淋巴細(xì)胞免疫功能的確認(rèn)巨噬細(xì)胞抗原提呈作用的揭示細(xì)胞因子的研究免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)單克隆抗體制備技術(shù)的問(wèn)世免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展（單克隆抗體標(biāo)記技術(shù)、免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)、分子雜交技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)等）。,20世紀(jì)獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)的免疫學(xué)家 年代 學(xué)者姓名 國(guó)家 獲獎(jiǎng)成就 19

10、01Behring德國(guó)發(fā)現(xiàn)抗毒素，開(kāi)創(chuàng)免疫血清療法 1905Koch德國(guó)發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌，發(fā)明診斷結(jié)核病的結(jié)核菌素 1908Ehrlich德國(guó)提出抗體生成側(cè)鏈學(xué)說(shuō)和體液免疫學(xué)說(shuō)Metchnikoff 俄國(guó)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬作用，提出細(xì)胞免疫學(xué)說(shuō) 1912Carrel法國(guó)器官移植 1913Richet法國(guó)發(fā)現(xiàn)過(guò)敏現(xiàn)象 1919Bordet比

11、利時(shí)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體, 建立補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 1930Landsteiner奧地利發(fā)現(xiàn)人紅細(xì)胞血型 1951Theler 南非發(fā)明黃熱病疫苗 1957Bovet意大利抗組胺藥治療超敏反應(yīng) 1960Burnet 澳大利亞提出抗體生成的克隆選擇學(xué)說(shuō)Medawar英國(guó)發(fā)現(xiàn)獲得性移植免疫耐受性 1972Edelman美國(guó)闡明抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Por

12、ter英國(guó)闡明抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu),20世紀(jì)獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)的免疫學(xué)家,1977Yalow美國(guó)創(chuàng)立放射免疫測(cè)定法 1980Dausset法國(guó)發(fā)現(xiàn)人白細(xì)胞抗原Snell 美國(guó)發(fā)現(xiàn)小鼠H-2系統(tǒng)Benacerraf 美國(guó)發(fā)現(xiàn)免疫應(yīng)答的遺傳控制Jerne丹麥提出天然抗體選擇學(xué)說(shuō)和免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō) Kohler德國(guó)雜交瘤技

13、術(shù)制備單克隆抗體Milstein阿根廷 單克隆抗體技術(shù)及Ig基因表達(dá)的遺傳控制Tonegawa日本抗體多樣性的遺傳基礎(chǔ)Murray美國(guó)第一例腎移植成功Thomas美國(guó)第一例骨髓移植成功 1996Doherty澳大利亞 提出MHC限制性，即T細(xì)胞的雙識(shí)別模式Zinkernagel瑞士提出MHC限制性，即T細(xì)胞的雙識(shí)別模式,2024/3/12,YHLO專業(yè)

14、培訓(xùn),15,免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史,1896年，Herbert發(fā)明特異性凝集現(xiàn)象,Widal發(fā)明Widal試驗(yàn)診斷 傷寒;1897年，Kmus發(fā)現(xiàn)鼠疫桿菌的培養(yǎng)濾液能與相應(yīng)抗血清發(fā)生沉淀 反應(yīng)；1898年, Kraus 發(fā)明沉淀試驗(yàn)1899年，Bordet發(fā)現(xiàn)免疫溶血反應(yīng)1900年，Landsteiner在特異血凝現(xiàn)象的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了人類ABO血 型，1930 年獲得諾貝爾生理學(xué)和

15、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1902年，Ascoli 建立了環(huán)狀沉淀試驗(yàn)1905年，Bechhold 建立了明膠沉淀試驗(yàn)1906年，Wassermann發(fā)明梅毒補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng),2024/3/12,17,YHLO專業(yè)培訓(xùn),免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史,1935年，Heidelberger，純化抗體技術(shù)，定量沉淀反應(yīng)1942年，Coons建立了熒光素標(biāo)記技術(shù)1946年，Oudin建立了試管單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1951年，Ouchterlony建立了雙向平板法雙

16、向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1953年，Grabar建立了免疫電泳1953年，Crabar與Williams建立補(bǔ)體結(jié)合技術(shù)1959年，Singer首創(chuàng)免疫電鏡技術(shù)1960年，Yalow建立了放射免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù),2024/3/12,18,YHLO專業(yè)培訓(xùn),免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史,1965年，Mancini建立了平板單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1971年，Engvall 和 Perlmann，Van Weeman 和

17、 Schuurs 建立了酶標(biāo)記的固相免疫測(cè)定技術(shù) （ELISA）1971年，Rubenstein等建立了均相酶免疫測(cè)定技術(shù)1975年，Koher和 Milstein，雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗 體1980年，Tonegawa，免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu) ······,2024/3/12,19,YHL

18、O專業(yè)培訓(xùn),自然的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)）加速的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（電泳技術(shù)、分離技術(shù)）標(biāo)記性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性半自動(dòng)、自動(dòng)化檢驗(yàn)儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合，加快了反應(yīng)過(guò)程標(biāo)記技術(shù)、單克隆技術(shù)、高智能自動(dòng)化技術(shù)的最佳組合,,,,免疫技術(shù)發(fā)展的發(fā)展進(jìn)程,,二、免疫分析技術(shù)的種類,分為兩大類別：細(xì)胞免疫測(cè)定技術(shù)和體液免疫測(cè)定技術(shù)。 體液免疫技術(shù)又可分為體內(nèi)法

19、和體外法。體外法即體外抗原抗體反應(yīng)，包括抗原、抗體、補(bǔ)體以及其他有關(guān)因素的定量、半定量或定性測(cè)定方法，舊稱血清學(xué)反應(yīng)；體內(nèi)法則利用皮膚試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。 細(xì)胞免疫測(cè)定也可以分為體外法和體內(nèi)法兩類。,2024/3/12,21,YHLO專業(yè)培訓(xùn),1、免疫沉淀技術(shù),包括液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)、免疫電泳、免疫比濁等。其中在經(jīng)典的免疫電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，又衍生出對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳、交叉免疫電泳、免疫固定電泳等許多

20、新技術(shù)和新方法出現(xiàn)。免疫濁度法則可以分為免疫透射濁度、免疫乳膠濁度和免疫速率濁度測(cè)定法等。,2024/3/12,22,YHLO專業(yè)培訓(xùn),2、免疫凝集技術(shù),括血凝、膠凝、菌凝、碳凝等微粒技術(shù)。其中磁性微粒(magnetic microspheres, MMS) 是80年代初，用高分子材料和金屬離子為原料，聚合而成的一種以金屬離子為核心，外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。在液相中，受外加磁場(chǎng)的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分離，無(wú)需進(jìn)

21、行離心沉淀。因此，將MMS應(yīng)用于免疫檢測(cè)，可使操作過(guò)程大為簡(jiǎn)化。,2024/3/12,23,YHLO專業(yè)培訓(xùn),3、放射免疫技術(shù),放射免疫測(cè)定法是以放射性同位素作為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法，一般可以分為三種類型： 1、以同位素標(biāo)記抗原和受檢測(cè)標(biāo)本中的抗原與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的經(jīng)典放射免疫測(cè)定法，RIA。 2、以同位素標(biāo)記的抗體與受檢標(biāo)本中的抗原結(jié)合，然后用固相抗原分離游離的標(biāo)記抗體的免疫放射測(cè)定，IRMA。

22、3、以同位素標(biāo)記的抗原或抗體及固相的抗原或抗體作為試劑，按固相酶免疫疫測(cè)定相似的方式檢測(cè)受檢標(biāo)本中的抗原或抗體的固相放射測(cè)定，SPRIA。,2024/3/12,24,YHLO專業(yè)培訓(xùn),4、免疫熒光技術(shù),分為免疫組織化學(xué)技術(shù)與免疫測(cè)定兩大類。免疫熒光測(cè)定分均相與非均相。非均相熒光免疫測(cè)定與ELISA極為相似，差別僅為標(biāo)記物和測(cè)定方式不同。而均相熒光免疫測(cè)定則有其特點(diǎn)，常用方式為時(shí)間分辨熒光法和均相熒光免疫測(cè)定。 熒光免疫組織化

23、學(xué)技術(shù)則與組織化學(xué)染色技術(shù)相似，最后用熒光顯微鏡判斷結(jié)果。,2024/3/12,25,YHLO專業(yè)培訓(xùn),5、酶聯(lián)免疫技術(shù),是以酶標(biāo)記抗體或抗原作為主要試劑的免疫測(cè)定方法。是標(biāo)記免疫技術(shù)應(yīng)用于最廣泛的一種，也是應(yīng)用最多的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。 有關(guān)該類方法原理、分類、應(yīng)用、特點(diǎn)、局限性等，將在后續(xù)介紹。,2024/3/12,26,YHLO專業(yè)培訓(xùn),6、免疫膠體金技術(shù),是以膠體金標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，對(duì)樣本中相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行檢測(cè)。

24、 檢測(cè)方法包括組織細(xì)胞染色、層析、斑點(diǎn)，均為非均相檢測(cè)法。未來(lái)可能發(fā)展均相檢測(cè)法。,2024/3/12,27,YHLO專業(yè)培訓(xùn),7、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),利用特異性抗體對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用需要補(bǔ)體參與而建立起來(lái)的一類檢測(cè)方法。主要包括補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和細(xì)胞溶解反應(yīng)。 這類檢測(cè)參與的反應(yīng)物質(zhì)有5種成分：已知抗原或抗體，待測(cè)抗體或抗原，溶血素、補(bǔ)體、紅細(xì)胞。其中后起3種成份又稱為指示系統(tǒng)。發(fā)生溶血反應(yīng)為試驗(yàn)陰性，不發(fā)生溶血

25、反應(yīng)為試驗(yàn)陽(yáng)性。,2024/3/12,28,YHLO專業(yè)培訓(xùn),8、中和試驗(yàn),是用以測(cè)定抗體的中和能力的試驗(yàn)，即中某種抗原或中和攜帶該抗原的微生物的如病毒感染性或細(xì)菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)能力的試驗(yàn)。其可以中和該抗原的生物學(xué)效應(yīng)之外，也可以用于疾病診斷或病毒鑒定。 該試驗(yàn)檢測(cè)的是中和指數(shù)，目前較少應(yīng)用。,2024/3/12,29,YHLO專業(yè)培訓(xùn),9、免疫組織化學(xué),又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原

26、抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。,2024/3/12,30,YHLO專業(yè)培訓(xùn),10、免疫電鏡技術(shù),是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的

27、一種高度精確、靈敏的方法。 特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。,2024/3/12,31,YHLO專業(yè)培訓(xùn),11、流式細(xì)胞技術(shù),能快速、精確地測(cè)量通過(guò)檢測(cè)區(qū)液流中的各種粒子。這些粒子可以是細(xì)胞、大分子、乳膠滴或其他粒子。流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)。 通常是應(yīng)用一個(gè)激光和有關(guān)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)收集這

28、些信號(hào)以供分析。其檢測(cè)速度之快，統(tǒng)計(jì)學(xué)精度之高，是其他方法無(wú)法比擬的。它可以研究一個(gè)細(xì)胞從新生到死亡，從細(xì)胞膜到腦漿和核內(nèi)物質(zhì)及染色體，還可以探討不同物質(zhì)之間的關(guān)系。同時(shí)它還可以從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多種參數(shù)(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等)，進(jìn)行多信息分析，為細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究提供強(qiáng)而有力的手段。,2024/3/12,32,YHLO專業(yè)培訓(xùn),12、免疫印跡技術(shù),又稱蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是一種借助特異性

29、抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白（抗原）的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）或非變性電泳（Native -PAGE）等分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。,2024/3/12,33,YHLO專業(yè)培訓(xùn),三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的發(fā)展,對(duì)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的文獻(xiàn)分析

30、 Fifa在Pub-Med檢索系統(tǒng)中輸入“enzyme-immunoassay”，“enzyme-linked immunoasay”，“RIA”三個(gè)單詞，從1965日至2005年，以每五年為一個(gè)階段，檢索了期間發(fā)表的論文，結(jié)果令人驚異。RIA法的高峰處在80年到90年之間，90年之后到2000年論文數(shù)量逐漸減少。而以EIA或者ELISA為關(guān)鍵詞的文章，在80年以后迅速增長(zhǎng)，90年代以后穩(wěn)定在每5年4萬(wàn)篇左右，目前還未

31、見(jiàn)有下降的趨勢(shì)。,2024/3/12,34,YHLO專業(yè)培訓(xùn),四、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的應(yīng)用,均相酶免疫測(cè)定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測(cè)。 非均相免疫測(cè)定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測(cè)，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前

32、列腺特異性抗原等）。,2024/3/12,35,YHLO專業(yè)培訓(xùn),主要試劑: 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性 酶對(duì)底物的催化活性,,抗原抗體反應(yīng)的特異性,+,酶高效催化反應(yīng)的專一性,原理及特點(diǎn),2024/3/12,36,YHLO專業(yè)培訓(xùn),HRP的常見(jiàn)底物,鄰苯二胺 OPD,四甲基聯(lián)苯胺 TMB,5-氨基水楊酸5-ASA,2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻

33、唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,2024/3/12,37,YHLO專業(yè)培訓(xùn),酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的特點(diǎn),特異性高靈敏度高穩(wěn)定性好操作簡(jiǎn)便對(duì)環(huán)境污染小成本較低,2024/3/12,38,YHLO專業(yè)培訓(xùn),特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、 準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí) 間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒(méi)有 污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián) 衍生出適用范圍更廣 的新方法。,原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗

34、原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析,原理及特點(diǎn),2024/3/12,39,YHLO專業(yè)培訓(xùn),酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的局限性,洗滌損失影響因素較多定性試驗(yàn)的陰性、陽(yáng)性判定值與均相方法比較，定量檢測(cè)中的準(zhǔn)確度、精密度及線性尚欠理想。,2024/3/12,40,YHLO專業(yè)培訓(xùn),應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析的產(chǎn)品,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前用ELISA技術(shù)建立或開(kāi)發(fā)的檢測(cè)項(xiàng)目多達(dá)千余項(xiàng)，通過(guò)商業(yè)機(jī)構(gòu)可購(gòu)的檢

35、測(cè)試劑盒多達(dá)300種，其中常用的檢測(cè)試劑盒有近100余種。 概括起來(lái)，可以這樣描述，凡是可以取得抗原物質(zhì)的所有物品，幾乎都可以建立ELISA檢測(cè)方法。,2024/3/12,41,YHLO專業(yè)培訓(xùn),五、酶免疫分析技術(shù)的分類,2024/3/12,42,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,酶免疫技術(shù),,酶免疫組化,酶免疫測(cè)定,,均 相,非均相,,固相酶免疫測(cè)定,液相酶免疫測(cè)定,組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位,液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量,2

36、024/3/12,43,YHLO專業(yè)培訓(xùn),用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定,酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。,原理,（一）均相酶免疫測(cè)定,2024/3/12,44,YHLO專業(yè)培訓(xùn),最具代表性的兩種技術(shù),酶放大免疫測(cè)定技術(shù)EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供體免疫分析

37、 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay,均相酶免疫測(cè)定,2024/3/12,45,YHLO專業(yè)培訓(xùn),分類：液相酶免疫測(cè)定 固相酶免疫測(cè)定 以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免疫測(cè)定,與均相不同之處,需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物,（二）非均相酶免疫測(cè)定,2024/3/12,46,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,底物顯色定性或定量的分析,原理,包

38、被,反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體,洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離,1,2,3,4,ELISA基本原理,2024/3/12,47,YHLO專業(yè)培訓(xùn),固相的抗原或抗體,酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）,酶反應(yīng)的底物,三個(gè)必要試劑,方法類型及其反應(yīng)原理,2024/3/12,48,YHLO專業(yè)培訓(xùn),（1）雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶 標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：

39、 二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,A、ELISA檢測(cè)抗原的方法,2024/3/12,49,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,2024/3/12,50,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,,,1、已知抗體包 被于載體表面,3、加酶標(biāo)抗體 與抗原結(jié)合,4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色,2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合,4、加酶作用的底物 不產(chǎn)生顏色,,,,雙抗體夾心法測(cè)抗原,,1、已知抗體包

40、 被于載體表面,2、加待檢物無(wú)抗 原與抗體結(jié)合,3、加酶標(biāo)抗體 無(wú)抗原結(jié)合,+,-,Y,,Y,E,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,Y,,Y,Y,,,,Y,Y,Y,Y,Y,Y,2024/3/12,51,YHLO專業(yè)培訓(xùn),（2）競(jìng)爭(zhēng)法 方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo) 抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合 加底物顯色。 應(yīng)用

41、：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（ 藥物、激素等）,A、ELISA檢測(cè)抗原的方法,2024/3/12,52,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,2024/3/12,53,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,,,,,,,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,+,-,,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,Y,Y,E,Y,,,,2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合,3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱,3、加酶作用的底物顯色,1、已知抗體包被于載體表面

42、,1、已知抗體包被于載體表面,2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合,2024/3/12,54,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,（1）間接法方法 用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG （抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn) 一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定,B、ELISA檢測(cè)抗體的方法,2024/3

43、/12,55,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,,2024/3/12,56,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,,,,,,,1、已知抗原吸附于載體表面,2、加待檢物無(wú)抗體與抗原結(jié)合,3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合,4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色,1、已知抗體吸附于載體表面,2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合,3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體,4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色,,,,間接法測(cè)抗體,,,,-,,,,,,,Y,E,Y,,,,,,,,,,,+,2024/3/12,57,

44、YHLO專業(yè)培訓(xùn),（2）雙抗原夾心法原理 類似雙抗體夾心法操作步驟 類似 應(yīng)用 乙型肝炎表面抗體,B、ELISA檢測(cè)抗體的方法,2024/3/12,58,YHLO專業(yè)培訓(xùn),（3）競(jìng)爭(zhēng)法原理 類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法 應(yīng)用 乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和 乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè),B、ELISA檢測(cè)抗體的方法,2024/3/12,59,YHLO專業(yè)培訓(xùn),（4）捕獲法 應(yīng)用

45、 病原體急性感染診斷中的IgM型抗體 甲型肝炎HAV-IgM抗體 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體,B、ELISA檢測(cè)抗體的方法,2024/3/12,60,YHLO專業(yè)培訓(xùn),捕獲法,原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體 底物顯色,,,,2024/3/12,61,YHLO專業(yè)培訓(xùn),,,,,,,捕獲法原理,,+,-,,,,,1、

46、固相化抗人　IgM,,1、固相化抗人　IgM,2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合,3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合,4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色,2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合,3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合,4、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合，加底物不顯色,2024/3/12,62,YHLO專業(yè)培訓(xùn),六、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的設(shè)備,1、加樣器

47、 2、洗板機(jī) 3、孵育箱 4、加速儀 5、酶免分析儀 6、數(shù)據(jù)分析方法 7、結(jié)果報(bào)告系統(tǒng),2024/3/12,63,YHLO專業(yè)

48、培訓(xùn),七、酶聯(lián)分析所需使用的材料,（ 1）抗原：純化抗原、合成抗原、基因工程抗原。（ 2）抗體：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體。（ 3）酶標(biāo)抗體或抗原：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、 B-半乳糖苷 酶等。（ 4）酶色原底物：鄰苯二胺（OPD）、ABTS、四甲基聯(lián)苯胺 （TMB）；對(duì)硝基苯磷酸鹽（pNPP）,酶發(fā)光底物（魯米諾、 A

49、MPPD）。（ 5）微孔反應(yīng)板（ 6）洗滌液、終止劑（7）陽(yáng)性質(zhì)控品（8）陰性質(zhì)控品,2024/3/12,64,YHLO專業(yè)培訓(xùn),標(biāo)記酶的要求： 活性高 性質(zhì)穩(wěn)定 專一性強(qiáng) 酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量 方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉,（一）酶和酶作用底

50、物,2024/3/12,65,YHLO專業(yè)培訓(xùn),辣根過(guò)氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無(wú)關(guān) 輔基是酶的活性中心,RZ值：403nm （輔基）　　　與275nm（主酶） 　　　OD值之比,RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要,ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶,,,,,常用酶,酶和酶作用底物,2024/3/12,66,YHLO專業(yè)培訓(xùn),堿性磷酸酶（AP）,菌源性AP 腸粘膜AP,β–半乳糖

51、苷酶（β-Gal）,用于均相酶免疫測(cè)定,常用酶,酶和酶作用底物,2024/3/12,67,YHLO專業(yè)培訓(xùn),HRP的底物,DH2+H2O2→ → → D+2H2O,HRP,供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種,H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,2024/3/12,68,YHLO專業(yè)培訓(xùn),OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。,TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加

52、酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm ，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。,HRP的常見(jiàn)底物,酶和酶作用底物,2024/3/12,69,YHLO專業(yè)培訓(xùn),AP的底物,β-Gal的底物,對(duì)-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ）,經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405 nm。,酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物 ，用熒光計(jì) 測(cè)量。,常用底物,酶和酶作用底物,2024/3/

53、12,70,YHLO專業(yè)培訓(xùn),酶免疫技術(shù)的核心組成部分,酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物,（二）酶標(biāo)記抗體或抗原,2024/3/12,71,YHLO專業(yè)培訓(xùn),抗原要求純度高，抗原性完整,抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。,制備方法要求,酶標(biāo)記抗體或抗原,2024/3/12,72,YHLO專業(yè)培訓(xùn),制備方法要求,技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，

54、重復(fù)性好,標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性,酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不形成聚合物,酶標(biāo)記抗體或抗原,2024/3/12,73,YHLO專業(yè)培訓(xùn),制備方法,過(guò)碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原,戊二醛交聯(lián)法,酶標(biāo)記抗體或抗原,2024/3/12,74,YHLO專業(yè)培訓(xùn),戊二醛交聯(lián)法,戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。,酶標(biāo)記抗體或抗

55、原,2024/3/12,75,YHLO專業(yè)培訓(xùn),純化及鑒定,標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度,常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過(guò)柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純,酶標(biāo)記抗體或抗原,2024/3/12,76,YHLO專業(yè)培訓(xùn),固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方

56、法,固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面,（三）固相載體,2024/3/12,77,YHLO專業(yè)培訓(xùn),要求,結(jié)合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原牢固地固定在其表面 不影響免疫反應(yīng)性 利于反應(yīng)充分進(jìn)行 固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì),種類,塑料制品 微顆粒膜載體,固相載體,2024/3/12,78,YHLO專業(yè)培訓(xùn),將抗原或抗體結(jié)合于固相載體,用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)

57、，消除非特異性吸附,包被coating,封閉blocking,包被與封閉,2024/3/12,79,YHLO專業(yè)培訓(xùn),八、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的未來(lái)發(fā)展,1、基因工程抗原或抗體試劑2、新型標(biāo)記物3、免疫傳感器4、多聯(lián)檢測(cè)5、自動(dòng)化、信息化6、集成化和微型化,2024/3/12,80,YHLO專業(yè)培訓(xùn),九、科樂(lè)士全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)的特點(diǎn),新型酶免法 1、獨(dú)特的試驗(yàn)裝置 2、多試劑集中儲(chǔ)置 3

58、、獨(dú)立單人份使用 4、一次性試劑 5、密閉試劑 6、信息條碼化 7、自備校正血清 8、自備質(zhì)控血清 9、即開(kāi)即用 10、單組份酶底物 11、高靈敏顯色劑 12、全自動(dòng)檢測(cè) 13、定量檢測(cè) 14、5點(diǎn)定標(biāo) · · · ·

59、83; ·,2024/3/12,81,YHLO專業(yè)培訓(xùn),十、科樂(lè)士產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣視角與辯點(diǎn),您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU您YOU 你們有什