精品白斯古楞論文答辯

1、,,論文答辯,歡迎各位老師指導(dǎo),dthv提供：拓展培訓(xùn)http://www.4006707009.com,抗癌活性肽對(duì)大腸癌LOVO細(xì)胞及相關(guān)凋亡基因的影響,學(xué) 科 專(zhuān) 業(yè)：外科學(xué)導(dǎo) 師 姓 名：王茂春 教授指 導(dǎo) 教 師: 蘇秀蘭 教授研 究 生 姓 名：白斯古楞,,前言,大腸癌為人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病死率極高。在我國(guó)的發(fā)病率有大幅度提高，病死率也不斷上升，已經(jīng)位居惡性腫瘤死亡率的第4～5位[3,4] 。目前大腸癌的治療

2、還是以手術(shù)治療為主，但即使結(jié)直腸癌病人接受了根治性手術(shù)，復(fù)發(fā)率仍較高，而再次手術(shù)的機(jī)會(huì)又很小[5]。大腸癌的高發(fā)病率與相對(duì)低存活率表明對(duì)其需要一種更有效的治療策略，需要積極探索大腸癌生物治療的新方法，以提高患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生命，為全身治療創(chuàng)造條件。,抗癌活性肽（Anticancer bioactive peptide，ACBP)是一種天然活性物質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量小于800kd，屬于小分子多肽[13,14,15] 。具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖

3、和激活免疫系統(tǒng)的雙重作用，大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)證明，ACBP能夠抑制胃癌，卵巢癌，鼻咽癌，膽囊癌等多種腫瘤細(xì)胞的DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化，降低腫瘤患者血液粘稠度，改善微循環(huán)，調(diào)節(jié)患癌機(jī)體無(wú)氧糖酵解，提高機(jī)體免疫力。,P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高，研究最廣泛、深入的基因之一。p53分為野生型(wild-type p53,wtp53)和突變型(mutant-type p53,mtp53）[7] 。野生型p53

4、 對(duì)細(xì)胞的分裂和增殖起負(fù)調(diào)控作用，是抑癌基因。而p53蛋白由于不穩(wěn)定，易發(fā)生突變，一旦p53發(fā)生突變，就會(huì)喪失野生型p53 基因所具有的細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生、介導(dǎo)細(xì)胞衰老、維持基因穩(wěn)定和錯(cuò)配基因修飾等抑癌功能，同時(shí)獲得許多癌基因的特殊功能。,Bcl-2基因家族分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是抗凋亡蛋白，另一類(lèi)是促凋亡蛋白[8]。bcl-2、Bcl-xl屬于Bcl-2基因家族成員中抗凋亡蛋白一類(lèi)。bcl-2基因能抑制細(xì)胞凋亡而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，但不

5、能促進(jìn)細(xì)胞增殖，即細(xì)胞凋亡抑制基因。,Bcl-xl基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員的代表，為抑制凋亡的蛋白，在人體各組織中均有表達(dá)[11]。 Bcl-xl功能與bcl-2相似，能與Bak蛋白一起形成異二聚體，來(lái)中和Bak蛋白的促凋亡作用，從而抑制細(xì)胞的凋亡。,研究目的,探討抗癌活性肽（ACBP）對(duì)大腸癌細(xì)胞株的凋亡和p53、bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步完善抗癌活性肽對(duì)大腸癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制，證實(shí)其對(duì)大腸癌細(xì)胞有生

6、長(zhǎng)抑制的作用。,,實(shí)驗(yàn)路線圖,,體外培養(yǎng)大腸癌lovo細(xì)胞,分為NS、5-FU、ILP三組,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡RT--PCR方法檢測(cè)p53、Bcl-2 、Bcl-xl基因的表達(dá),得出結(jié)論,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,,,,,取3-4代的細(xì)胞,,作用24h,,實(shí)驗(yàn)方法,體外培養(yǎng)人體大腸癌lovo細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)分組：將大腸癌lovo細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇,放入在37℃、5% CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)更換DMEM培養(yǎng)基一次,待細(xì)胞融合時(shí)

7、用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3-4代的細(xì)胞，分別加入生理鹽水( 0.5mL，對(duì)照組)、5-FU ( 0.5mL，陰性對(duì)照組) 、抗癌活性肽( 0.5mL，用藥組),用藥24h后倒置顯微鏡下觀察各組lovo細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。收集細(xì)胞加入1ml的Trizol 提取總RNA細(xì)胞總RNA鑒定：1％的瓊脂糖電泳來(lái)鑒定細(xì)胞總RNA，觀察出現(xiàn)的各個(gè)條帶及條帶亮度。,總RNA提取步驟：,收集細(xì)胞，加入1ml的Trizol,室溫靜置5min,加入

8、氯仿0.2ml/管,室溫靜置5min,上清液轉(zhuǎn)至新離心管,漩渦振蕩30s后離心,棄上清，加入1ml75%乙醇洗滌,室溫靜置10min,棄上清，保留沉淀,溶解于適量的DEPC水中,,,,,,,,,,冰上放置5min,12000g，4℃，離心5min,劇烈震蕩混勻,一般500ml洗兩次,12000g，4℃，離心5min,12000g，4℃，離心5min,12000g，4℃，離心5min,12000g，4℃，離心3min室溫晾干,加入等體積異

9、丙醇，上下顛倒,DU800紫外分光光度計(jì)測(cè)定：分別測(cè)定細(xì)胞的總RNA光密度值(OD)在260nm和280nm處的,并計(jì)算RNA的含量和純度。要求RNAOD260/OD280值在1.5-2.0之間，濃度在500ug/ml以上的符合實(shí)驗(yàn)條件。RT-PCR半定量方法檢測(cè)抗癌活性肽（ACBP）對(duì)大腸癌lovo細(xì)胞p53、bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)的影響。,RT反應(yīng)液配置 試劑

10、 使用量 5×PrimeScript®Buffer 4 μl PrimeScript®RT Enzyme Mix I 1 μl Oligo dT Primer（50 μM） 1 μl Total RNA 根據(jù)濃度計(jì)算體積RNase Free dH2O

11、 up to 20 μl 注：Total RNA用量為1ug 。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min *3（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)） 85℃ 5 sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）,PCR反應(yīng)液配制（15ul） 試劑 使用量 5×PrimeSTAR

12、4;Buffer（Mg2+ plus） 3.00 μl dNTP Mixture（各2.5 mM） 1.20 μl Primer 1（10 μM） 0.20 μl Primer 2（10 μM） 0.20 μl cDNA產(chǎn)物（10 pg/μl）

13、 3.00 μl PrimeSTAR®HS DNA Polymerase 0.15 μl 滅菌蒸餾水 up to 15.00 μl,PCR引物詳細(xì)序列 Sequence(5'to3')

14、 Product(bp) Tm p53 F ATGAAGCTCCCAGAATGCCA 264 52℃ p53 R AATCAACCCACAGCTGCACA 264 52℃ Bcl-xl F CCTGCCTGCCTTTGCCTAA 244

15、 53℃ Bcl-xl R TAAACTGACTCCAGCTGTATC 244 53℃ bcl-2 F GGTGCCACCTGTGGTCCACCT 261 55℃ bcl-2 R CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG 261 55℃ GAPDH F CCTCAACGACCACTTTG

16、TCA 103 50-60℃ GAPDH R TTACTCCTTGGAGGCCATGT 103 50-60℃,PCR反應(yīng)條件如下 ：94 ℃ 5min 1 Cycle94 ℃ 30sec 52 ℃、53℃或55 ℃* 1

17、5sec 25 Cycle72 ℃ 30sec 72 ℃ 7min 1 Cycle4 ℃ 保存注：p53退火溫度為52攝氏度，bcl-2退火溫度為55攝氏度, Bcl-xl退火溫度為53攝氏度。,,實(shí)

18、驗(yàn)采用GAPDH片段作為內(nèi)參照。P53、bcl-2、Bcl-xl、GAPDH引物采用Oligo 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由invitrogen公司合成。瓊脂糖凝膠電泳 ：取PCR產(chǎn)物5ul，加5xLoading Buffer 2ul，2%瓊脂糖凝膠電泳 110V，100mA，25min，凝膠成像儀成像并保存結(jié)果。凝膠圖像分析軟件半定量分析測(cè)定灰度值。,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，兩組以上比較采用方差

19、分析，SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。,實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備,分光光度儀 培養(yǎng)箱 顯微鏡 超凈臺(tái) 低溫超速離心機(jī),實(shí)驗(yàn)結(jié)果,加入生理鹽水24h后見(jiàn)lovo細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,形態(tài)良好呈梭形或多角形，胞質(zhì)均勻透明，隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。,用藥前和用藥24h后（倒置顯微鏡下，

20、5;100，x400）,生理鹽水組,加入5-FU 24h后見(jiàn)lovo細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞變小、變圓、折光率減弱、核濃縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)。,用藥前和用藥24h后（倒置顯微鏡下，×100，x400）,5-FU組,加入ILP 24h后見(jiàn)lovo細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞變小、變圓、折光率減弱、核濃縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)。,用藥前和用藥24h后（倒置顯微鏡下，×100，x400）,抗癌活性肽組,細(xì)胞總RNA1％瓊脂糖電泳,細(xì)胞總RNA

21、1％瓊脂糖電泳可見(jiàn)清晰的兩條條帶，分別為18S和28S。,紫外分光光度計(jì)測(cè)定： 分別測(cè)定細(xì)胞總RNA在260nm和280nm處的光密度值(OD),并計(jì)算RNA的含量和純度。數(shù)據(jù)顯示RNA純度均在OD260/OD280比值1.5-2.0之間，濃度在400-2500ug/ml之間，符合RT-PCR實(shí)驗(yàn)條件。,RT-PCR檢測(cè)p53基因RNA水平表達(dá)：,ACBP組與5-FU組p53基因RNA表達(dá)水平明顯低于NS組p53基因RNA表達(dá)

22、。,p53 RT-PCR電泳圖,RT-PCR檢測(cè)bcl-2基因RNA水平表達(dá)：,ACBP組與5-FU組bcl-2基因RNA表達(dá)水平明顯低于NS組p53基因RNA表達(dá)。,bcl-2 RT-PCR電泳圖,RT-PCR檢測(cè)Bcl-xl基因RNA水平表達(dá)：,ACBP組與5-FU組Bcl-xl基因RNA表達(dá)水平明顯低于NS組p53基因RNA表達(dá)。,Bcl-xl RT-PCR電泳圖,在ACBP組、5-FU組和NS組中GAPDH的表達(dá),GAPDH

23、RT-PCR電泳圖,在ACBP組、5-FU組和NS組中GAPDH均有表達(dá),大腸癌lovo細(xì)胞p53、Bcl-2、Bcl-xl基因總RNA表達(dá)（n=3， ）,注：*P<0.01，**P<0.01 VS NS組,討論,抗癌活性肽(anti—cancer bioactive peptide，ACBP)來(lái)源于經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)動(dòng)物臟器，以現(xiàn)代生物技術(shù)分離、提取的一種新型抗癌生物制劑[19]。在將近十年多的研究中，目前已經(jīng)完成了對(duì)小白鼠

24、及大白鼠進(jìn)行的急毒和長(zhǎng)毒試驗(yàn)，表明ACBP對(duì)正常的生理過(guò)程及酶的代謝基本上沒(méi)有干擾，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。,本課題組前期研究證實(shí)：?通過(guò)MTT細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)：ACBP抗癌作用的有效濃度為25ug/ml，最有效作用時(shí)間為24小時(shí)。?ACBP：大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，ACBP能夠抑制胃癌、大腸癌、白血病、卵巢癌、膽囊癌等多種腫瘤細(xì)胞的DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡并使細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，降低腫瘤病人機(jī)體血液黏稠度，提高免疫力。

25、,本實(shí)驗(yàn)選用25ug/mlACBP對(duì)大腸癌lovo細(xì)胞株作用24小時(shí)，觀察結(jié)果可見(jiàn)ACBP其抑癌作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，以進(jìn)一步探討證實(shí)ACBP的抗癌作用機(jī)理，并通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)p53、bcl-2、Bcl-xl基因觀察其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，為其在臨床應(yīng)用提供更為完善的理論依據(jù)。,腫瘤是因人體細(xì)胞中調(diào)控因子的平衡調(diào)控發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖而誘發(fā)的。在體內(nèi)外各種致癌因素的作用下，p53基因發(fā)生缺失或

26、突變，使其編碼的蛋白質(zhì)喪失了抑制細(xì)胞增值的作用，導(dǎo)致細(xì)胞的無(wú)限增值而引發(fā)腫瘤。變異的p53蛋白不僅喪失了阻止正常細(xì)胞發(fā)生癌變的作用，還由于突變所產(chǎn)生的異常功能(Gain of function)啟動(dòng)一些原癌基因的過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[22.23]。,bcl-2基因是原癌基因到目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系最密切的基因之一。正常組織中bcl-2在自身穩(wěn)定性方面起著重要作用, 一般在記憶B淋巴細(xì)胞和壽命長(zhǎng)的干細(xì)胞群及胸腺

27、髓質(zhì)細(xì)胞里較多，如:結(jié)腸、子宮內(nèi)膜、前列腺和皮膚中，但在上皮細(xì)胞分化末期較少出現(xiàn)。bcl-2蛋白在正常細(xì)胞中可表達(dá)于激活和發(fā)育過(guò)程，也可表達(dá)于成熟組織中，在人體多種形態(tài)的腫瘤細(xì)胞中亦可表達(dá)，走向凋亡的細(xì)胞中卻低表達(dá)或不表達(dá)[28]。,Bcl-xl的表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程相關(guān)。該基因有2種類(lèi)型:一種為Bcl-xl，與bcl-2蛋白有協(xié)同作用；另一種為Bcl-xs，與bcl-2蛋白有抑制作用[30]。Bcl-xl的功能與bcl-2比

28、較相似，可與Bak蛋白形成異二聚體，來(lái)中和Bak基因的促凋亡作用，使抑制細(xì)胞凋亡[31]。研究表明, Bcl-xl/bax比例是決定細(xì)胞對(duì)凋亡刺激信號(hào)敏感的重要因素[33]。當(dāng)Bcl-xl表達(dá)過(guò)量時(shí)，細(xì)胞可免遭凋亡，反之，在誘導(dǎo)劑的作用下細(xì)胞容易發(fā)生凋亡。,Bcl-2家族與p53的基因調(diào)控也是有著相互聯(lián)系的。一些學(xué)者認(rèn)為bcl-2能抑制p53來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)突變型p53是由于其在mRNA及蛋白水平下調(diào)bcl-2表達(dá)來(lái)抑制細(xì)

29、胞凋亡，從而成為了bcl-2的調(diào)控因子。有研究發(fā)現(xiàn)，p53基因失活時(shí), 使bcl-2家族的基因調(diào)控失衡，引起凋亡抑制基因Bcl-xl在mRNA水平升高，致使靶細(xì)胞不容易誘發(fā)細(xì)胞凋亡。,本試驗(yàn)中，通過(guò)lovo細(xì)胞培養(yǎng)，鏡下觀察和RT-PCR檢測(cè)p53、bcl-2、Bcl-xl基因發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)和RNA表達(dá)兩個(gè)方面的研究提示：ACBP對(duì)大腸癌lovo細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡作用，可能是其治療大腸癌的重要機(jī)制之一，同時(shí)也進(jìn)一步明確了ACBP

30、的抗腫瘤療效。為抗癌活性肽對(duì)大腸癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，提示其具有潛在的臨床應(yīng)用前景。,結(jié)論,抗癌活性肽可能通過(guò)降低細(xì)胞中p53基因的表達(dá)，下調(diào)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖能力，發(fā)揮其抗腫瘤作用。抗癌活性肽的抗腫瘤作用可能與下調(diào)大腸癌lovo細(xì)胞中bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。,【參考文獻(xiàn)】1. 姚國(guó)棟, 蘇秀蘭, 烏新林等. 抗癌活性肽對(duì)荷人胃癌裸鼠細(xì)胞凋亡及BcL-2、Bax表達(dá)的影響[J] .內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)

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39、0.14.Manne U, Weiss HL, Grizzle WE. Bcl-2 expression isassociated with improved prognosis in patients with distalcolorectal adenocarcinomas. Int J Cancer, 2000, 89:423～430.,致謝,難忘的研究生學(xué)習(xí)即將結(jié)束，首先衷心感謝我的導(dǎo)師王茂春教授對(duì)我的培養(yǎng)和指導(dǎo)。導(dǎo)師不僅傳授

40、我專(zhuān)業(yè)知識(shí)，更教我做人的道理，使我有信心成為一名既有醫(yī)術(shù)又有醫(yī)德的好醫(yī)生。您淵博的學(xué)識(shí)、精湛的醫(yī)術(shù)、高尚的醫(yī)德、樸實(shí)無(wú)華的作風(fēng)是我一生學(xué)習(xí)的榜樣。在此，向辛勤栽培我的恩師致以最誠(chéng)摯的謝意！特別感謝附院臨床醫(yī)學(xué)研究中心蘇秀蘭教授對(duì)本課題的精心指導(dǎo)，衷心感謝蘇依拉老師、張嘉玲老師、賈淑琴老師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的悉心指導(dǎo)和熱忱幫助。衷心感謝普通外科C區(qū)所有老師在我學(xué)習(xí)生涯中給予的指導(dǎo)、教誨和幫助。感謝你們讓我在收獲知識(shí)的同時(shí)，收獲了友情和快