食品微生物第十二章常見致病g資料

1、第十二章 常見革蘭氏陽性致病菌,基本內(nèi)容: 葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）、單核細胞增生李斯特氏菌和蠟樣芽孢桿菌的基本生物學(xué)特性，來源、分布及傳播途徑，導(dǎo)致的常見疾?。òY狀和致病機理），常用檢測方法，預(yù)防和控制方法。,重點和難點: 金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌和蠟樣芽孢桿菌的生物學(xué)特性，常見病癥狀和致病機理，檢測方法。,第一節(jié) 葡萄球菌和金黃色葡萄球菌病,一、概述,1880年，巴斯德首次從一患者瘀腫

2、的膿汁中發(fā)現(xiàn)葡萄狀排列的細菌，將其注射給家兔后可致膿瘡；,1883年，Becker獲得了純培養(yǎng)，證實該菌為葡萄球菌屬；,,,,1881年，Ogsten確證化膿過程是“某”菌所致；,一、概述,葡萄球菌（Staphylococcus)因堆聚成葡萄串狀而得名，為最常見的化膿性球菌；,葡萄球菌屬在分類地位上屬于微球菌科的一個屬（目前有32種，寄生人體的有16種），大部分為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病。葡萄球菌是醫(yī)院交叉感染的重要來源。,,,金黃色葡

3、萄球菌（S.aureus),表皮葡萄球菌（S.epedermidis),腐生葡萄球菌（S.saprophyticus),金黃色葡萄球菌為最常見致病菌,一、概述,美國CDC報道：美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大為45%；我國和其它國家也有類似的情況。,金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)在自然界中無處不在，空氣、土壤、水、飼料、食品、灰塵及人和動物的排泄物中均可找到；,一

4、、概述,,,二、葡萄球菌的基本特性,2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu) 葡萄球菌呈球形或稍呈橢圓形，直徑0.4～1.2μm，分裂后許多菌體無規(guī)則的堆積在一起，成葡萄串狀。,葡萄球菌無鞭毛，不能運動。無芽胞，除少數(shù)菌株外一般不形成莢膜。易被常用的堿性染料著色，革蘭氏染色為陽性。,二、葡萄球菌的基本特性 (2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)）,其衰老、死亡或被白細胞吞噬后，以及耐藥的某些菌株可被染成革蘭氏陰性。,二、葡萄球菌的基本特性,2.2 培養(yǎng)特征,營養(yǎng)要求

5、不高，普通瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，不透明的菌落。,在含有血液和葡萄糖的培養(yǎng)基中生長更佳。 在肉湯培養(yǎng)基中24h后呈均勻混濁生長。 需氧或兼性厭氧，少數(shù)專性厭氧。,不同種的菌株產(chǎn)生不同的色素，色素為脂溶性，如金黃色、白色、檸檬色。 血瓊脂平板上形成的菌落較大，有的菌株菌落周圍形成明顯的全透明溶血環(huán)（β溶血），也有不發(fā)生溶血者。 凡溶血性菌株大多具有致病性。,二、葡萄球菌

6、的基本特性（2.2 培養(yǎng)特征）,金黃色葡萄球菌（β溶血）,表皮葡萄球菌,28-38℃均能生長，致病菌最適溫度為37℃，pH為4.5-9.8，最適為7.4；,二、葡萄球菌的基本特性（2.2 培養(yǎng)特征）,在含有20～30% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，可產(chǎn)生大量毒素。,耐鹽性強，在含有10～15%的NaCl培養(yǎng)基中能生長；,二、葡萄球菌的基本特性,2.3 生理生化特性,各種葡萄球菌的主要生理生化特性,各種葡萄球菌的主要生理生化性狀（續(xù)表）,二、葡萄

7、球菌的基本特性（2.3 生理生化特性）,二、葡萄球菌的基本特性（2.3 生理生化特性）,注：“＋”為陽性，“－”為陰性。,各種葡萄球菌的主要生理生化性狀（續(xù)表）,二、葡萄球菌的基本特性,2.4 抗原結(jié)構(gòu),葡萄球菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)的有30種以上，對其活性及組成比較了解的有以下幾種：,2.4.1 葡萄球菌A蛋白 （Staphylococcal protein A， SPA) SPA是存在于90%以上的金黃色葡萄球菌細胞壁表

8、面的一種蛋白質(zhì)， 是一種單鏈多肽，與細胞壁肽聚糖共價連接，但有1/3分泌于胞外。,SPA為完全抗原，具有特異性，它可與人IgG1、 IgG2和IgG4的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合。 具有與吞噬細胞競爭Fc段復(fù)合物、促細胞分裂、引起超敏反應(yīng)、損傷血小板等多種生物活性。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原結(jié)構(gòu)）,所有來自人類的菌株均有此抗原，動物源株則少見。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原結(jié)構(gòu)）,2.4.2 多糖抗原 多糖抗原為

9、半抗原，有兩種，具群特異性，可用以分群。 A群多糖抗原多存在于金黃色葡萄球菌，其化學(xué)組成為N-乙酰葡萄糖胺核糖醇磷壁酸（多糖A）。 B群多糖抗原多存在于表皮葡萄球菌，化學(xué)組成是N-乙酰葡萄糖甘油型磷壁酸（多糖B）。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原結(jié)構(gòu)）,2.4.3 莢膜抗原 主要為金黃色葡萄球菌菌株的表面抗原。,幾乎所有金黃色葡萄球菌菌株表面都有莢膜抗原的存在，個別表皮葡萄球菌菌株有此抗原。,二、葡萄

10、球菌的基本特性,2.5 抵抗力,葡萄球菌抵抗力較強，為不形成芽孢的細菌中最強者。 在干燥的膿汁或血液中可存活數(shù)月；80℃加熱30 min才能將其殺死，煮沸可迅速使其死亡；在5%石炭酸或0.1%汞中10～15min死亡。 對某些染料較敏感，1∶100 000～1∶200 000稀釋的龍膽紫溶液能抑制其生長；對磺胺類藥物的敏感較低，對青霉素、紅霉素和慶大霉素高度敏感。,葡萄球菌腸毒素是一種外毒素，具耐熱性，經(jīng)100℃加熱30

11、min而不被破壞，要使其完全破壞需煮沸2h（葡萄球菌腸毒素的特點）；,二、葡萄球菌的基本特性（2.5 抵抗力）,其他如溶血素、殺白血球素等經(jīng)100℃加熱10min或80℃加熱20min就可喪失毒性。,二、葡萄球菌的基本特性,2.6 金黃色葡萄球菌噬菌體型 依據(jù)：絕大多數(shù)金黃色葡萄球菌可被相應(yīng)的噬菌體裂解。,根據(jù)噬菌體對金黃色葡萄球菌菌株的裂解反應(yīng)，可將金黃色葡萄球菌分為5群26型（見下表）：,二、葡萄球菌的基本特性（2.6

12、金黃色葡萄球菌噬菌體分型）,金黃色葡萄球菌噬菌體分型,二、葡萄球菌的基本特性（2.6 金黃色葡萄球菌噬菌體分型）,腸毒素型食物中毒主要是由Ⅲ、Ⅳ群的金黃色葡萄球菌引起； 造成醫(yī)院感染嚴重流行的多為Ⅰ群中的52、52A、80型引起。,噬菌體分型在金黃色葡萄球菌流行病學(xué)調(diào)查、追蹤傳染源及研究菌型與疾病的關(guān)系等方面均有重要意義。,,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑,3.1 分布 流行呈季節(jié)性分布，多見于夏、秋兩季。

13、 引起中毒食品種類：奶、肉、蛋、魚及其制品等動物性產(chǎn)品；此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕、涼粉等也經(jīng)常被其污染而導(dǎo)致中毒。,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑,3.2 污染途徑,不同人群或動物金黃色葡萄球菌帶菌率,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑,途徑二：食品二次污染,熟肉類食品如在熟后污染了致病性葡萄球菌，又在20～30℃的環(huán)境下放置較長時間，極易引起中毒； 奶和奶制品，用奶制作的冷飲（冰激凌、冰棍）和奶油糕點常是引起中毒的

14、食品；,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途徑（3.2 污染途徑）,油煎雞蛋、熏魚、油浸魚罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產(chǎn)生毒素。,,四、金黃色葡萄球菌的致病性,4.1 致病類型及癥狀,有侵襲性疾病和毒素性疾病兩種類型。4.1.1 侵襲性疾病癥狀：主要引起化膿性感染。 金黃色葡萄球菌可通過多種途徑侵入肌體，引起局部組織、內(nèi)臟器官或全身性化膿感染。,局部感染主要表現(xiàn)為：甲溝炎、麥粒腫、蜂窩織炎、傷口化膿等；

15、,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,甲溝炎,麥粒腫,蜂窩織炎,內(nèi)臟器官感染如：肺炎、膿胸、中耳炎、腦膜炎、心包炎、心內(nèi)膜炎等； 全身感染如：敗血癥、膿毒血癥等。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,心包炎,心內(nèi)膜炎,4.1.2 毒素性疾病,,主要由金黃色葡萄球菌毒素所致。毒素性疾病有兩種：,A. 食物中毒： 人攝入含毒素污染的食物后1～6h即可出現(xiàn)頭暈、惡心、腹瀉、嘔吐等急性胃腸炎癥狀。

16、發(fā)病1～2d可自行恢復(fù)，愈后良好。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（4.1 致病類型及癥狀）,B. 毒性休克綜合癥 由毒性休克綜合癥毒素1（TSST-1）引起。 主要表現(xiàn)：高熱、低血壓、嘔吐、腹瀉、猩紅樣皮疹、嚴重者出現(xiàn)休克。 注意： TSST-1并非是引起該綜合癥的唯一病因，細菌內(nèi)毒素、葡萄球菌腸毒素也與毒性休克綜合癥發(fā)病有關(guān)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性,4.

17、2 致病因子及相應(yīng)致病機理,金黃色葡萄球菌的致病性取決于其產(chǎn)生的毒素的致病能力。,4.2.1 血漿凝固酶（Coagulase) 是一種能使含有檸檬酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人血漿發(fā)生凝固的酶。 大多數(shù)致病性葡萄球菌可產(chǎn)生此酶，非致病菌則不產(chǎn)生。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,血漿凝固酶有2種：,A：游離凝固酶（free coagulase) 分泌至胞外，被血漿中凝固酶

18、反應(yīng)因子激活，形成葡萄球菌凝血酶（staphylothrombin)，能使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，導(dǎo)致血漿凝固。 纖維蛋白沉積于菌體表面，阻礙體內(nèi)吞噬細胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被殺死。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,凝固酶集聚在菌體四周，可能保護病菌不受血清中殺菌物質(zhì)的作用。,B：結(jié)合凝固酶（bound coagulase) 也叫凝聚因子（clumping factor

19、)，在菌體表面并不釋放，為纖維蛋白原特異性受體，能與人或兔血漿中纖維蛋白原交聯(lián)而引起細菌凝聚。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,凝固酶試驗是鑒定金黃色葡萄球菌的重要標志。,凝固酶較耐熱，100℃加熱30min或高壓滅菌后仍保存部分活性，但易被蛋白分解酶破壞。,凝固酶具有免疫原性，刺激機體產(chǎn)生的抗體對凝固酶陽性的細菌感染有一定的保護作用。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,凝固

20、酶具抗原性，可用于金黃色葡萄球菌的分型研究及流行病學(xué)研究。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,4.2.2 溶細胞毒素 該毒素為膜損傷毒素，主要有葡萄球菌溶素（staphylolysin)和殺白細胞素（leukocidin)。,A：葡萄球菌溶素 外毒素，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生，可使動物紅細胞溶解，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致

21、病因子及相應(yīng)致病機理）,根據(jù)其對動物細胞的溶血范圍、抗原性、溶血時所需溫度不同等可將金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的葡萄球菌溶素分為α、β、γ、δ、ε五種。 五種溶素都是蛋白質(zhì)，具抗原性。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,對人體有致病作用的主要是α溶素和β溶素。,α溶素：由質(zhì)?；蛉旧w編碼，分子量為30kD，不耐熱， 60℃加熱3min即可被破壞。除對多種哺乳動物紅細胞有溶血作用外，對白細胞、血小板、肝細

22、胞、成纖維細胞膜、血管平滑肌等均有毒性作用，可引起組織壞死。 作用機理：毒素分子插入細胞膜疏水區(qū)，從而破壞膜完整性造成細胞溶解。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,β溶素：為神經(jīng)鞘磷脂酶C （sphingomyelinase C)，能水解細胞膜磷脂，損傷紅細胞、白細胞、巨噬細胞和纖維細胞，與組織壞死和膿腫形成有關(guān)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,B：殺白細胞素

23、 又稱為Panton-Valentine(PV)殺白細胞素，由大多數(shù)致病性葡萄球菌產(chǎn)生，不耐熱，有F和S兩個組分。細胞膜上，S組分的受體主要是神經(jīng)節(jié)苷脂GM1；F組分受體則為卵磷脂。,致病原理：殺白細胞素與受體結(jié)合，改變細胞膜的結(jié)構(gòu)，使細胞對陽離子（K離子）的通透性增加，引起人和動物中性粒細胞和巨噬細胞的損傷，最終導(dǎo)致細胞死亡。 死亡細胞可形成膿栓，加重組織感染；大量吞噬細胞的損傷可影響肌體的免疫防御能力。,

24、四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,4.2.3 葡萄球菌腸毒素(staphylococcus enterotoxin, SE),葡萄球菌腸毒素：為血漿凝固酶或耐熱核酸酶陽性菌株產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似、毒力相似、抗原不同的胞外蛋白質(zhì)。,金黃色葡萄球菌是引起食品污染的常見細菌，被其污染的食品中，在20～37C下經(jīng)4－8h即可產(chǎn)生大量的毒素。約有30～50

25、%的菌株可以產(chǎn)生腸毒素。,基本特性：蛋白質(zhì)，分子量為26KD～30KD，熱穩(wěn)定，100℃30min不被破壞，不受胰蛋白酶影響，能抵抗胃液中蛋白酶的水解作用。,資料報道，在每100g食物中含有不足18μg的葡萄球菌腸毒素便能引起金黃色葡萄球菌食物中毒癥狀。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,迄今從血清型上已被鑒定的SE有11種，分別為：A、B、C

26、、D、E、F、G、H、I、J、K型，其中C型又根據(jù)等電點的不同分為3個亞型（C1、C2、C3）。 各型腸毒素均可引起食物中毒，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之，F(xiàn)型腸毒素是引起毒性休克癥的毒素。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,致病機理：葡萄球菌腸毒素是一種超抗原，和普通抗原相比，可激活更多的T細胞，釋放過量的細胞因子（如INF，IL-1，IFN-γ）而致病。 另外，該毒素在腸

27、道作用于內(nèi)脂神經(jīng)受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產(chǎn)生急性胃腸炎癥狀。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的急性腸胃炎病一般潛伏期為1～6小時，最短者0.5小時即發(fā)病，出現(xiàn)頭暈、嘔吐、腹瀉等癥狀，發(fā)病1～2日可自行恢復(fù)，預(yù)后良好。,1-6小時,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,4.2.4 剝脫毒素（exfoliatin),該毒素由蛋白質(zhì)組成。,致病機理

28、：具絲氨酸蛋白酶功能，可裂解細胞間橋小體，破壞細胞間的連接，引起葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合癥（staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS)。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,4.2.5 毒性休克綜合癥毒素1（toxin shock syndrome toxin-1,TSST-1),該毒素也稱致熱外毒素C和

29、腸毒素F，是某些金黃色葡萄球菌在生長過程中分泌的一種外毒素。該毒性蛋白由細菌染色體編碼，含有194個氨基酸，分子量為2.049KD。 毒素結(jié)構(gòu)類似于葡萄球菌腸毒素B，引起發(fā)熱、休克及脫屑性皮疹，稱為毒性休克綜合癥（toxic shock syndrome，TSS）。,致病機理： ①抑制內(nèi)毒素脫毒或直接損傷肝臟細胞，使內(nèi)毒素在體內(nèi)蓄積；②刺激單核吞噬細胞系統(tǒng)釋放血管活性物質(zhì)，干擾心血管系統(tǒng)及血液動力學(xué)；③增加毛細

30、血管通透性，造成心血管功能損傷而導(dǎo)致休克。,四、金黃色葡萄球菌的致病性（ 4.2 致病因子及相應(yīng)致病機理）,五、金黃色葡萄球菌的檢測,5.1 常用檢測方法：GB/T4789.10—2008,流程：,五、金黃色葡萄球菌的檢測（5.1 常用檢測方法）,S. aureus on Baird-Parker Agar,五、金黃色葡萄球菌的檢測,5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測方法,5.2.1 金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基,Baird-Parker-f-

31、RPF培養(yǎng)基 由法國生物梅里埃公司研制，該培養(yǎng)基是在BP瓊脂的基礎(chǔ)上加入RPF（兔血漿纖維蛋白原）。,該培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，以氯化鋰代替亞碲酸鉀， 血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落。,五、金黃色葡萄球菌的檢測（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測方法）,五、金黃色葡萄球菌的檢測（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測方法）,5.2.2 3M金黃色葡萄球菌快速測試法,原理：Petrifilm.RSA Cou

32、nt Plate由美國3M公司研制生產(chǎn)，是一種薄膜型快速檢測金黃色葡萄球菌的記數(shù)平板。,3M? Petrifilm? Staph aureus Count,測試薄膜是由二部分組成。 第一部分是黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片。此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker營養(yǎng)成分及冷水可溶解的膠質(zhì)。 第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應(yīng)片。含有DNA、甲苯胺藍 ( Toluidine 

33、;Blue-O )及四唑指示劑 (Tetraeolium)，此指示劑有助于菌落的計數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。,五、金黃色葡萄球菌的檢測（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測方法）,耐熱脫氧核糖核酸酶為產(chǎn)毒金黃色葡萄球菌的典型特征酶，是鑒定金黃色葡萄球菌的標志酶之一。 在Petrifilm. RSA 檢測片上，耐熱DNA酶反應(yīng)呈粉紅色環(huán)帶，包圍著一個紅色或藍色的菌落。,五、金黃色葡萄球

34、菌的檢測（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測方法）,五、金黃色葡萄球菌的檢測,5.3 金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測方法,5.3.1 動物學(xué)試驗法,五、金黃色葡萄球菌的檢測（5.2 金黃色葡萄球菌快速檢測方法）,5.3.2 血清學(xué)試驗法 金黃色葡萄球菌腸毒素為胞外蛋白，為超抗原，可用ELISA法進行檢測。,5.3.3 分子生物學(xué)方法 如：核酸分子雜交法和PCR法?？捎脕頇z測編碼腸毒素的特異性基因（entA、entB、 entC、

35、entD、entE等）。,六、金黃色葡萄球菌的預(yù)防與控制措施,6.1 防止金黃色葡萄球菌污染食品 　（1）防止帶菌人群對各種食物的污染：定期對生產(chǎn)加工人員進行健康檢查，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）的人員要暫時停止其工作或調(diào)換崗位。,（2）防止金黃色葡萄球菌對奶及其制品的污染： 如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒

36、素生成、細菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。,六、金黃色葡萄球菌的預(yù)防與控制措施（6.1 防止金黃色葡萄球菌污染食品 ）,（3）防止金黃色葡萄球菌對肉及其制品的污染：對肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當方式處理后進行加工生產(chǎn)。,6.2 防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成 　　應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超過6小時，并

37、且食用前要徹底加熱。,六、金黃色葡萄球菌的預(yù)防與控制措施,第二節(jié) 單核細胞增生李斯特氏菌及其食物中毒,一、概論 單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytohenes）是一種能在冷藏溫度存活的致病菌。 其細胞的苯酚-水浸出物可以誘導(dǎo)單核細胞的生成。,一、概論,1891年和1911年：有文獻記載和描述過該細菌； 1926年：Murray等首次在患病兔和豚鼠肝臟中分離到單核細胞增生李斯特

38、氏菌； 1929年：最先記錄人類感染單核細胞增生李斯特氏菌，之后它被確診為引起孕婦產(chǎn)期感染腦膜炎的元兇。,1999年底，美國發(fā)生了歷史上因食用帶有李斯特菌的食品而引發(fā)的最嚴重的食物中毒事件。 據(jù)美國CDC資料顯示，在美國密歇根州有14人因食用被該菌污染的 “熱狗”和熟肉而死亡，在另外22個州97人患此病，6名婦女流產(chǎn)。,一、概論,,2001年11月以來，我國質(zhì)檢部門多次在從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等

39、二十多家肉類加工廠進口的豬腰、豬肚、豬耳、小排等三十多批近千噸豬副產(chǎn)品中檢出單增李斯特菌、沙門氏菌等致病菌。,一、概論,一、概論,,李斯特氏菌屬有七個菌種： （1）單核細胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes) （2）綿羊李斯特菌 (L.ivanovii) （3）英諾克李斯特菌 (L.innocua) （4）威爾斯李斯特菌 (L.welshimeri) （5）西爾李斯特菌 (L.seeliger) （6

40、）格氏李斯特菌 (L.grayi) （7）默氏李斯特菌 (L.murrayi),二、生物學(xué)特性,2.1形態(tài)特征,G+，類球形桿菌，大小為（0.4～0.5）um×（0.5～2.0）um，直或彎曲，兩端鈍圓，單個、呈V字型排列或成隊排列，兼性厭氧，無芽孢，一般不形成莢膜（營養(yǎng)豐富環(huán)境可形成），陳舊培養(yǎng)物中菌體可呈絲狀、革蘭氏染色陰性，有4根周毛和1根鞭毛，周毛易脫落。,二、生物學(xué)特性,2.2 培養(yǎng)特征,通常在大多數(shù)細菌培養(yǎng)基上

41、生長良好。,（1）胰蛋白胨瓊脂 單核細胞增生李斯特菌最佳培養(yǎng)保存用培養(yǎng)基。形成圓形、光滑、稍扁平的透明菌落。,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),(2) 在含2.5g/L瓊脂、80g/L明膠和10g/L葡萄糖的半固體培養(yǎng)基中: 37℃培養(yǎng)24h，生長物沿穿刺線以不規(guī)則云霧狀延伸到培養(yǎng)基內(nèi)，進而擴散到整個培養(yǎng)基。生長達最高量時在培養(yǎng)基表面下3～5mm處形成一似傘狀界面。,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),(3)

42、羊肝浸出液瓊脂 透射光觀察為圓形、光滑、奶油狀、稍扁平菌落；反射光觀察為乳白色菌落。 菌落有光滑型、中間型和粗糙型三種。,（4）血瓊脂平板 菌落周圍有溶血帶或溶血圈。少數(shù)菌株強烈溶血，其余菌株溶血較弱。,A,B,C,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),該菌生長需要B族維生素（生長素、核黃素、硫胺素和硫辛酸）和氨基酸（半胱氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸等）。 適宜在中性或偏堿性的介質(zhì)中生長，pH范圍為5.2～

43、9.6，在低于5.2條件下仍可存活數(shù)周到數(shù)月。 抗鹽能力強，在0～4℃條件下，該菌在25.5%NaCl水溶液中可存活數(shù)月。,二、生物學(xué)特性(2.2 培養(yǎng)特征),,單核細胞增生李斯特菌是嗜冷菌，在0～ 50℃及冰箱溫度下均能生長。最適生長溫度為37℃。,Growth and Survival of Listeria at Low Temperatures,二、生物學(xué)特性,2.3 生化特性,李斯特氏菌屬不同種間生化特性,二、生物學(xué)特性

44、（2.3 生化特性）,李斯特氏菌屬不同種間生化特性（續(xù)表）,注：+，90%菌株呈陽性反應(yīng)； －，90%菌株呈陰性反應(yīng)；d，11—89%菌株呈陽性反應(yīng)。,二、生物學(xué)特性,2.4 血清型分類,單核細胞增生李斯特氏菌具有菌體抗原（O）和鞭毛抗原（H），有13個血清型，見下表（含其他李斯特菌）：,李斯特氏菌屬不同菌種間血清型分布,二、生物學(xué)特性（2.4 血清型分類）,單增李斯特菌13個血清型中，其中： 3種（1/2a、1/2b和4b）占臨

45、床感染的90%； 最常見的為1/2b； 通常引起食源性感染的是4b。1966年以來，有記載爆發(fā)的24起單核細胞增生李斯特氏菌疾病中14起屬于4b，占58%；8起屬于1/2a，占11%。,二、生物學(xué)特性,2.5 抵抗力,對理化因素抵抗力較強：在土壤、糞便、青儲飼料和干草內(nèi)能長期存活；,對堿和鹽抵抗力強：25g/L NaOH中經(jīng)20min才殺死，在200g/L NaCl中4℃可存活8周；,60～70℃加熱5～20min可殺死；

46、 70%酒精、25g/L 石炭酸、 25g/L 福爾馬林20min可殺死； 對氯霉素、青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、新霉素和磺胺藥物敏感，抗多粘菌素。,二、生物學(xué)特性（2.5 抵抗力）,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn),在自然界廣泛分布，能耐受較高的滲透壓。 易從健康的人和動物體、腐爛的果品蔬菜、土壤、動物產(chǎn)品、糞便、青儲飼料、水及水產(chǎn)品等載體中分離。,3.1 分布,,不同載體中單核細胞增生李斯特氏菌的

47、含菌量或檢出率,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.1 分布）,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.1 分布）,不同載體中單核細胞增生李斯特氏菌的含菌量或檢出率（續(xù)表）,3.2單核細胞增生李斯特氏菌污染食品造成的感染,帶菌食品類型： 軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰淇淋、生牛排、羊排、卷心菜沙拉、芹菜、番茄、法式餡餅和凍豬舌等。,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)

48、與臨床表現(xiàn),三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.1 分布）,途徑一：通過糞—口途徑進行傳播（主要途徑）；,傳播途徑：,途徑二：該菌還可通過眼睛及損傷皮膚、黏膜進入人體內(nèi)而造成感染；孕婦感染后通過胎盤或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒；性接觸也是本病傳播的可能途徑，且呈上升趨勢。,,傳播途徑及感染類型：,,,,,,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.2 傳播和感染）,3.3 流行病學(xué) 人類感染單核細胞增生李斯

49、特氏菌發(fā)病率為：2～15人/100 0000人，死亡率約為30%左右；通常免疫力低下、老人和感染菌血癥的嬰兒死亡率較高，有報道可高達75%。,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn),單核細胞增生李斯特氏菌引起的部分食源性疾病爆發(fā),三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn)（3.3 流行病學(xué)）,三、單核細胞增生李斯特氏菌的流行病學(xué)與臨床表現(xiàn),3.4 臨床癥狀,典型癥狀一: 個體免疫機能受損引起的感染，如：

50、 ①似流感樣癥（畏寒、發(fā)熱、頭痛和血尿等），死亡率較高，甚至達30%； ② 流產(chǎn)； ③死胎；④膿血癥；⑤腦膜炎,癥狀二：溫和性胃腸炎癥狀,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理,4.1 細菌的毒力島 單核細胞增生李斯特氏菌毒力島：又稱致病島，是指編碼該菌毒力基因簇的相對分子量比較大的染色體DNA片段。 特點：兩側(cè)一般具有重復(fù)序列和插入元件，通常位于細菌染色體

51、tRNA基因位點內(nèi)或附近，不穩(wěn)定，含有潛在的可移動元件。 基因產(chǎn)物：分泌性蛋白或細菌表面蛋白。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,編碼LM相關(guān)致病性的毒力基因有兩簇，稱單核細胞增生李斯特氏菌毒力島LIPI-1和單核細胞增生李斯特氏菌毒力島LIPI-2。4.1.1 毒力島LIPI-1及相關(guān)基因功能 位于9kb大小的染色體上，其兩側(cè)分別為prs和ldh位點，有6個基因，從p

52、rs下游開始，依次為prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB。,mpl-actA-plcB： 位于hly下游。Mpl基因產(chǎn)物mpl蛋白加工酶，為鋅依賴蛋白酶，能起到外毒素作用； actA基因編碼表面蛋白ActA，與細菌肌動蛋白聚合性運動有關(guān)，也與細菌被宿主細胞內(nèi)化有關(guān)。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,3種基因產(chǎn)物可使李斯特菌在宿主細胞與細胞之間互相傳遞，可有效避免宿

53、主免疫系統(tǒng)體液效應(yīng)蛋白損傷。,plcB基因編碼磷酸酯酶C，能水解宿主細胞上大多數(shù)的磷脂。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,Hly基因： 編碼Hly蛋白，大小60kD，稱為單核細胞增生李斯特氏菌溶解素（listeriolysin O),是一種孔形成毒素（pore-forming-toxin），能破壞吞噬體，促使菌體進入胞液，是細菌在胞液內(nèi)增殖的先決條件，是主要的毒力因子，其缺失將使細

54、菌毒力因子全部喪失。,,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,plcA-prfA基因： 位于hly基因上游，plcA編碼plcA磷脂酰肌醇-特異性磷脂酶C；prfA編碼prfA蛋白，是李斯特菌所有基因簇包括prfA本身轉(zhuǎn)錄激活所必須，是李斯特菌唯一的毒力因子調(diào)節(jié)蛋白。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,4.1.2 毒力島LIPI-2及相關(guān)基因功能,LI

55、PI-2又稱內(nèi)化素小島（internalin islets)，它是一個富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白質(zhì)家族。LM的內(nèi)化素分兩個型： 其一為相對分子量大的蛋白質(zhì)組成，通過其C-末端區(qū)黏附于細菌細胞壁上。此亞族代表是inlAB編碼的InlA和InlB多肽。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,,另一亞族由相對分子量較小的蛋白質(zhì)組成，他們?nèi)狈-末端細胞壁錨定區(qū)而釋放于胞外環(huán)境。 LIPI-2在

56、LM侵入宿主細胞的過程中起關(guān)鍵性作用，但目前仍不清楚其對LM致病的確切機理。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理(4.1細菌的毒力島 ）,4.2 低溫生長和耐酸特性,LM在食源性疾病傳播中的顯著特點之一是可在低溫條件下生長繁殖。 分子生物學(xué)研究表明：該菌能表達四種不同的應(yīng)激蛋白，即HrcA 、sigmaB、Clp家族和所謂的第四類基因編碼的三個冷休克蛋白。 近年來細菌的抗酸基因gad也被發(fā)現(xiàn)，其表達的蛋白能分

57、解膽鹽，從而有利于細菌在哺乳動物腸道存活。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理,4.3黏附與侵襲 LM能黏附和進入哺乳動物細胞。 LM通過表面的D-半乳糖殘基與宿主細胞的D-半乳糖受體接合，可使細菌吸附在消化道的上皮細胞上。其侵入可能是從腸道黏膜到達下層組織。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理,4.4 破壞宿主免疫,LM在宿主體內(nèi)感染途徑：,口（食物）,,胃腸道感染,,侵入上皮細胞后被單核巨噬細胞吞

58、噬,隨巨噬細胞擴散到局部淋巴結(jié),,,到達內(nèi)臟器官,四、單核細胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病機理,LM 侵入肌體后可在單核巨噬細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞及成纖維細胞等多種細胞內(nèi)存活，生長和繁殖，誘導(dǎo)以CD8+H和CD4+T細胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答。如CD4+誘導(dǎo)生成淋巴因子（特別是干擾素），CD8+直接裂解感染細胞。 但由于LM能在宿主細胞間生長繁殖，因而在很大程度上防止了宿主體液免疫的裂解反應(yīng)。,四、單核細胞增生李斯特氏菌的

59、致病因子及致病機理（4.4 破壞宿主免疫）,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測,5.1 常用檢測方法GB/T 4789.30—2003；SN 0184—1993美國FDA一次性增菌檢測方法美國USDA/FSIS檢測方法ISO檢測方法,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.1 常用檢測方法）,舉例：5.1.1 GB/T 4789.30-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏

60、菌檢驗,檢樣25g(ml),,,,,EB增菌液225ml,LB1增菌液225ml,LB2增菌液10ml,選擇性培養(yǎng)基（MMA）,,,,,,,30℃ 48h,30℃ 24h,30℃ 24h,,增菌,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.1 常用檢測方法）,選擇性培養(yǎng)基（MMA）,,,,,SIM動力培養(yǎng)基,TSI瓊脂,,,,,TSA-YE培養(yǎng)基,,,,革蘭氏染色,運動性觀察,,MR，VP實驗,硝酸鹽還原實驗,過氧化氫酶實驗,甘露醇,木糖醇,

61、鼠李糖,七葉苷,溶血試驗,協(xié)同溶血試驗,小鼠致病力試驗,,,,,,,,,,,30℃ 24h,30℃ 24h,25℃ 2～5d（傘狀）,30℃ 24～48h,5.1.2 FDA檢測方法—一次增菌培養(yǎng)檢測法,檢樣25g(ml),增菌肉湯225ml,LPM培養(yǎng)基,Oxford培養(yǎng)基,解剖鏡鏡檢,TSA-YE培養(yǎng)基,可疑菌落,生理生化試驗及形態(tài)檢驗,,,,,,,,,,,,,30℃，24～48h,35℃，24～48h,30℃，24～48h,五、單

62、核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.1 常用檢測方法）,Oxford-Agar mit Kolonien von Listeria monocytogenes,30℃，24～48h,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測,5.2 基于免疫學(xué)原理的檢測技術(shù),原理：ELISA應(yīng)用舉例： FDA批準使用的有Listeria-Tek ELISA和TECHRA可見免疫沉淀試劑盒； 加拿大食品檢驗局(CFIA)批準使用VIDAS

63、TM（bioMerieux)LMO1試劑盒和Oxoid Listeria Rapid Test(Clearview)試劑盒檢測李斯特氏菌屬的菌種；,2003年3月，加拿大批準了VIDASTM（bioMerieux)LMO2用于單核細胞增生李斯特氏菌檢測； 2003年，加拿大CFIA 批準了BioControl system Inc生產(chǎn)的可見免疫沉淀檢測試劑盒用于李斯特氏菌屬檢測。,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.

64、2 基于免疫學(xué)原理的檢測技術(shù)）,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測,5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗技術(shù),5.3.1 核酸分子雜交法舉例 美國USDA/FSIS和加拿大CFIA都批準使用AccuprobeTM檢測單核細胞增生李斯特氏菌的試劑盒。,DNA探針（化學(xué)熒光物質(zhì)丫啶黃嘌呤標記）,目標菌核糖體RNA,,雜交,,DNA-RNA,,,DNA探針,堿性條件下，標記物與過氧化氫作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,,內(nèi)酯鍵被水解，不發(fā)光,,用Gen

65、-Probe光度計檢測,,,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗技術(shù)）,5.3.2 PCR擴增法,加拿大CFIA批準使用PCR檢測在相關(guān)選擇性培養(yǎng)基上得到的可疑單核細胞增生李斯特氏菌菌落。 公布的官方擴增基因為hlyA基因，引物核酸序列為：F：5’-CATTAGTGGAAAGATGGAATG-3’R：5’-GTATCCTCCAGAGTGATCG-3’ 目標DNA大小為730bp.,

66、五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗技術(shù)）,5.3.3 Real-Time PCR,Real time PCR:即實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方法。 是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過Real time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進程中的熒光信號強度進行實時監(jiān)測，最終對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理的方法。,Advantages:(1) Allows us to actually view

67、 the increase in the amount of DNA as it is amplified(2) Quantitative(3) No need to run gels: rapid and simpler(4) Multiplexing ( > 1 target per reaction),五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗技術(shù)）,五、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測

68、（5.3 基于分子生物學(xué)原理的檢驗技術(shù)）,Molecular Beacon Technology,Detection of PCR product by molecular beacon,Molecular beacon,TaqMan® real-time PCR,,Probe with quenching dye and reporter dye,Probe and primer bind target DNA,Rep