基于碳納米管的慶大霉素免疫分析方法研究.pdf

1、慶大霉素是一類氨基糖苷類抗生素，在臨床治療和動物養(yǎng)殖中有著廣泛應(yīng)用。過量的抗生素使用對人類和環(huán)境存在危害。由于環(huán)境樣本中慶大霉素含量很低，對分析方法靈敏度有較高要求。以酶聯(lián)免疫分析方法為代表的生物分析方法，具有靈敏度高、檢測快速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，成為環(huán)境中污染物快速分析的新方向。本文通過制備的慶大霉素單克隆抗體，初步建立了基于碳納米管免疫新方法。
　　采用直接化學(xué)交聯(lián)法成功制備了免疫原GEN-BSA和包被原GEN-OVA，紫外掃描

2、鑒定證明反應(yīng)產(chǎn)物交聯(lián)成功。用免疫原免疫小鼠，三只小鼠抗慶大霉素血清達(dá)到預(yù)期抑制要求，選取其中抑制率最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，細(xì)胞融合后用間接競爭ELISA方法篩選出6株分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分別為2G5D12、2G5F8、2G5E7、2G5D7、2G5F5G7、2G5F5H7，試驗(yàn)對六株雜交瘤分泌的抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示單克隆抗體重鏈均為IgG2a型，輕鏈為K型。選取2G5D12細(xì)胞株制備腹水，通過體內(nèi)誘導(dǎo)法大量制備單克隆抗體，腹

3、水經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化得到純化單克隆抗體。
　　對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，采用抗原抗體最佳工作濃度和最優(yōu)條件繪制競爭抑制曲線，根據(jù)擬合曲線計(jì)算得檢測限（IC90）為0.026 ng/mL，半數(shù)抑制（IC50）為0.095 ng/mL，線性范圍（IC80-IC20）為0.042~0.2438 ng/mL。2G5D12單克隆抗體除了對妥布霉素有0.31％的交叉反應(yīng)率，和鏈霉素、新霉素、卡那霉素、核糖霉素、阿米卡星的交叉反應(yīng)率均在0.01%以

4、下。實(shí)驗(yàn)回收率范圍為74.3~126.8%，變異系數(shù)小于13.2%。試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。對環(huán)境樣本慶大霉素含量進(jìn)行分析，江蘇大學(xué)環(huán)境水樣中慶大霉素含量在0.04~0.1 ng/mL，而土壤中慶大霉素含量中在0.115~0.167 ng/mL。牛奶樣品中，慶大霉素含量在0.832~1.075 ng/mL；在動物組織中慶大霉素殘留量為1.946~3.577 ng/g，均未超出最高殘留限量。
　　合成GEN-HRP，并采用兩種方法將二抗偶聯(lián)

5、碳納米管；討論碳納米管合成產(chǎn)物非特異性結(jié)合；優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，選取2% BSA作為稀釋液，MWCNTs-PEG-GAM作為載體。建立了基于碳納米管的離心定量方法和過濾定性方法。離心定量法獲得慶大霉素抑制曲線，根據(jù)擬合曲線計(jì)算得檢測限（IC90）為0.048 ng/mL，半數(shù)抑制（IC50）為0.195 ng/mL，線性范圍（IC80~IC20）為0.080~0.512 ng/mL。實(shí)驗(yàn)測定四種樣品回收率和重復(fù)率，回收率范圍為60.1~13