細(xì)胞超微標(biāo)技術(shù)

1、細(xì)胞超微標(biāo)記示蹤技術(shù),前言,近十幾年來，國際上創(chuàng)造出許多細(xì)胞超微標(biāo)記與示蹤的細(xì)胞化學(xué)新技術(shù)，因而可以進(jìn)一步定性、定位和定量地分析某些特定的化學(xué)成分、物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其功能意義。用各種高電子密度的離子、分子或顆粒顯示組織、細(xì)胞的通透性、孔徑、通道或屏障以及某種帶負(fù)電荷結(jié)構(gòu)。,IF: 12.186 (2011),Chithrani et al. Nano Lett. 2006,Dependence of cellular uptake of g

2、old nanoparticles as a function of size,The graph of number of gold nanoparticles per vesicle diameter vs nanoparticle size,Chithrani et al. Nano Lett. 2006,(B-F) TEM images of gold nanoparticles with sizes 14, 30, 50, 7

3、4, and 100 nmtrapped inside vesicles of a HeLa cell, respectively.,正常細(xì)胞與納米材料的表面形態(tài),ZnO NPs附著于膠質(zhì)細(xì)胞表面引起質(zhì)膜表面囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,細(xì)胞表面囊泡增加,,,ZnO材料與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用,TiO2 P25導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面囊泡的聚集,TiO2 P25 6h,TiO2 P25 12h,TiO2聚集于細(xì)胞表面,細(xì)胞表面大量囊泡結(jié)構(gòu),,,第一節(jié) 超

4、微標(biāo)記示蹤技術(shù)的分類和評價(jià),非特異性標(biāo)記示蹤技術(shù)（一）重金屬真溶液標(biāo)記（二）陽離子染料（三）酶與金屬蛋白類特異性標(biāo)記示蹤技術(shù)（一）彌散性標(biāo)記物（二）顆粒性標(biāo)記物,第一節(jié) 超微標(biāo)記示蹤技術(shù)的分類和評價(jià),一、 非特異性標(biāo)記示蹤技術(shù)（一）重金屬真溶液標(biāo)記 如釕紅、硝酸鑭以及葡萄糖酸亞鐵等化合物中的重金屬，分子小，電子致密度高，所標(biāo)記的生物標(biāo)本可以在電鏡下觀察和研究某種組織、細(xì)胞的通透性。這些重金屬鹽可以通

5、過細(xì)胞連結(jié)和縫隙連接的小管，進(jìn)入細(xì)胞間隙和相鄰細(xì)胞，但不能進(jìn)入完整、未受損傷的細(xì)胞。（二）陽離子染料 如陽離子鐵蛋白，著染帶有負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)。（三）酶與金屬蛋白類 主要是辣根過氧化物和鐵蛋白。前者用辣根過氧化物酶（HRP）注入機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官，再用3.3-氨基聯(lián)苯胺（DAB）與其進(jìn)行組織化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生顯色物質(zhì)。該產(chǎn)物強(qiáng)嗜鋨，因而電鏡下也能著色示蹤。多用于研究小蛋白的追蹤、通透性及神經(jīng)通路

6、。鐵蛋白也可用來示蹤研究通透性。,二、特異性標(biāo)示技術(shù)（一）彌散性標(biāo)記物 1. 放射自顯影術(shù) 2. 酶標(biāo)記抗體或特異性復(fù)合物 3. 可溶性（非標(biāo)記）酶和抗酶復(fù)合物（PAP） 4. 生物素和卵白素（Biotin-avidin）復(fù)合標(biāo)記（二）顆粒性標(biāo)記物1. 鐵蛋白標(biāo)記復(fù)合物；2. 各種微球體標(biāo)記物3. 生物大分子標(biāo)記物，如α-2巨球蛋白；4. 金標(biāo)記復(fù)合物 作為

7、一項(xiàng)理想的技術(shù)方法，應(yīng)具有多功能、多用途，既能用于透射電鏡，也能用于掃描電鏡和X線衍射分析。金標(biāo)記技術(shù)能滿足這些要求，是很有價(jià)值的標(biāo)記示蹤技術(shù)。,磁性－熒光多功能復(fù)合微球制備原理圖,Fe3O4納米粒子的TEM圖,Fe3O4 @ SiO2 的透射電鏡TEM圖,第二節(jié) 鐵蛋白標(biāo)記技術(shù),鐵蛋白是含鐵的大分子，電子密度高，分子量為500,000 ~ 800,000。分子核心是磷酸羥化鐵，外包蛋白質(zhì)殼，總直徑小于12 nm。透射電鏡下為高電子密度

8、的細(xì)小顆粒。一、離子化鐵蛋白技術(shù)： 是一種非特異性標(biāo)記技術(shù)，利用陽離子化鐵蛋白和陰離子化鐵蛋白標(biāo)記細(xì)胞中具有負(fù)電荷或正電荷的結(jié)構(gòu)。二、鐵蛋白標(biāo)記抗體的免疫電鏡技術(shù)： 細(xì)胞與鐵蛋白標(biāo)記的抗體共同孵育、染色、包埋、超薄切片。在透射電鏡下借助于鐵蛋白的高電子密度，可以精確地、特異地顯示出相應(yīng)抗原的位置、分布。若用鐵蛋白標(biāo)記配體或其他物質(zhì)，則可以顯示、研究膜受體及膜特性。 此法的缺點(diǎn)是制備

9、繁雜困難，鐵蛋白顆粒過于細(xì)小不便觀察，超薄切片上非特異性反應(yīng)很強(qiáng)。,親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和糖基化鐵蛋白技術(shù)的應(yīng)用。親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的基本原理是將鐵蛋白與生物素交聯(lián)，利用生物素對卵白蛋白的高親和力、以生物素－卵白蛋白－配體（或抗體）為橋，將鐵蛋白標(biāo)記在細(xì)胞的特定結(jié)構(gòu)或物質(zhì)上，以觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)。使用生物素－卵白蛋白標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是方法靈敏，非特異性低，親和力極強(qiáng)，可以進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記，簡單方便，可以僅制備保存一種標(biāo)記卵白素或標(biāo)

10、記生物素，而進(jìn)行多種反應(yīng)，以顯示多種特定的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。,第三節(jié) 金微粒（膠體金）標(biāo)記技術(shù),一、金標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：1. 膠體金的制備容易、簡單、便宜2. 幾乎不出現(xiàn)非特異性吸附、標(biāo)記3. 可用不同的試劑和濃度嚴(yán)格控制所需金微粒的大小4. 能用多種方法定量分析標(biāo)記到細(xì)胞表面的金微粒5. 膠體金可以與抗體、多糖、外源凝集素和其他多種蛋白質(zhì)相連，生成標(biāo)記大分子而不影響大分子的生物活性，用途廣泛6. 可用于掃描電鏡和X線衍射

11、分析，這是其他標(biāo)記物無法比擬的,二、膠體金的特性、穩(wěn)定性基標(biāo)記原理 膠體金的特性主要取決于金微粒的直徑、吸收光譜及其穩(wěn)定性。金微粒的大小可以用透射電鏡直接測定。國際上通用的標(biāo)示方法如WGA-Au5。膠體金是一種疏水膠體，由吸附的周圍離子云維持膠體的穩(wěn)定性。膠體金的穩(wěn)定性取決于膠體粒子的大小，顆粒越小越穩(wěn)定，越不容易受電解質(zhì)的干擾而凝聚。,目前已有三種穩(wěn)定金屬膠體溶液防止凝聚的方法。（1）膠體顆粒表面吸附表面活性

12、物質(zhì)（如肥皂）以增加表面電荷密度及潛能。（2） 吸附親水大分子以降低粒子間的吸引力。（3）吸附高分子多聚體以增加膠體溶液的立體穩(wěn)定性。 此外，多糖和其他多聚物也能提高其立體穩(wěn)定性。,典型樣品的透射電子顯微鏡圖 (a) Fe3O4; (b) 氨基化Fe3O4; (c) 膠體金; (d) Fe3O4/Au (15-20 nm),王顯祥等，科學(xué)通報(bào). 2009; 54(4):430-435,直徑16~20 nm的膠體金

13、的制備： 用干凈非金屬藥勺和容器稱氯金酸50 mg，溶于500 ml三蒸水中，制成0.01%的氯金酸液，煮沸，快速加入1%枸掾酸鈉12.5 ml，邊加邊攪拌邊加熱，至5 min左右溶液由黃、藍(lán)，變成深紅色。冷卻后用碳酸鉀溶液調(diào)pH。注意： 玻璃器皿應(yīng)非常潔凈，實(shí)際加入的次序要正確，應(yīng)用高純度的去離子水。 注意顏色的變化: 電鏡下金微粒應(yīng)為圓球形或橢圓形的電子致密顆粒，不得有微粒的聚集凝結(jié)，

14、而應(yīng)完全呈現(xiàn)單個(gè)分散狀態(tài)?？稍跓o菌或特殊處理情況下保存數(shù)月。,四、金標(biāo)記物的制備,（一）制備大分子被標(biāo)記物中含有無機(jī)鹽時(shí)，會降低膠體顆粒間的排斥電荷，招致膠體凝聚或影響大分子的吸附和標(biāo)記，為此，需對金標(biāo)記的大分子進(jìn)行純化或透析。（二）金微粒標(biāo)記先要測定標(biāo)記大分子最適宜的標(biāo)記量、最適宜pH，以求得最佳的標(biāo)記效果和最穩(wěn)定的金標(biāo)記物溶液。此外，金和大分子蛋白間的等電點(diǎn)有關(guān)，蛋白質(zhì)與金結(jié)合的最佳點(diǎn)是在等電點(diǎn)或稍微偏堿。若膠體金的pH不合

15、適、膠體金顆粒太大，被標(biāo)記物質(zhì)的分子過小、數(shù)量過少，則易引起金粒凝集。這時(shí)可用小牛血清白蛋白與小肽交聯(lián)后，在進(jìn)行金標(biāo)記。,五、膠體金標(biāo)記物的應(yīng)用和研究,（一）光鏡中的應(yīng)用標(biāo)記物在光鏡下為桔紅色。金標(biāo)IgG在普通光鏡下計(jì)數(shù)組織、細(xì)胞。應(yīng)用Au-rhodamine ConA-avidin 復(fù)合物對同一細(xì)胞進(jìn)行光鏡、熒光鏡、電鏡的聯(lián)合觀察。若標(biāo)本用金標(biāo)記染色后再經(jīng)銀染，靈敏度更高。 （二）掃描電鏡中的應(yīng)用這是金標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)之一。因

16、金微粒有很強(qiáng)的發(fā)射二次電子的能力，故可以掃描電鏡觀察金標(biāo)記物在細(xì)胞表面的分布。此外，用不同大小的金微粒，還可進(jìn)行多重標(biāo)記。,（三） 透射電鏡中的應(yīng)用 在透射電鏡下，以將特異性金標(biāo)記法用于研究病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞神經(jīng)組織等，顯示細(xì)胞表面物質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。 常用的金微粒是Au5和Au20。 金標(biāo)記可分為直接法和間接法。 直接標(biāo)記法是用金標(biāo)記物直接標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)。一般說來，

17、標(biāo)記在細(xì)胞表面的金微粒數(shù)量，隨著金微粒的直徑的增大而減小。 間接標(biāo)記的反應(yīng)程序是標(biāo)本先用第一抗體血清處理后，再用金標(biāo)蛋白A或金標(biāo)第二抗血清處理。用間接法標(biāo)記的B淋巴細(xì)胞較直接法標(biāo)記的要強(qiáng)，非特異性要低。這可能是間接法可以提供更多的空間結(jié)合點(diǎn)之故。,（四） 超薄切片的金標(biāo)記法,膠體金是單一均質(zhì)微粒膠體，可以根據(jù)要求制備出不同規(guī)格、適合超薄切片的多重標(biāo)記。用金標(biāo)記超薄切片，需要戊二醛固定標(biāo)本，環(huán)氧樹脂包埋。 用直接法時(shí)，將超薄切

18、片裱到銅網(wǎng)上，或者將銅網(wǎng)漂浮在金標(biāo)液表面、室溫下反應(yīng)0.5~3 h，有時(shí)金標(biāo)液中加入少許小牛血清白蛋白，以進(jìn)一步減少非特異性吸附。 間接法是將帶有切片的銅網(wǎng)先與特異性抗血清在室溫下孵育2 h或4℃下2~4 h，緩沖液沖洗后再用金標(biāo)記物室溫孵育10 min~2 h，清洗后再用常規(guī)電鏡處理。目前有幾種間接法：,切片先用外源凝集素處理，然后與金標(biāo)記多糖或糖蛋白孵育，顯示外源凝集素－多糖或糖蛋白的標(biāo)記定位。該法較直接法反應(yīng)強(qiáng)，非特異性

19、吸附少，但較麻煩，每次要制備所用的金標(biāo)溶液。金－蛋白A法。該法根據(jù)蛋白A能特異結(jié)合到各種IgG的FC段，制備了一種金-蛋白A標(biāo)記液，使用各種不同的IgG抗血清，可顯示各種相應(yīng)的細(xì)胞抗原。需選擇合適的抗血清滴度或用金標(biāo)記免疫球蛋白替代金標(biāo)蛋白A。根據(jù)抗原抗體雙價(jià)結(jié)合原理，可用金標(biāo)記的抗原檢測特異抗體。用微過量的2價(jià)抗體與組織細(xì)胞反應(yīng)，使該2價(jià)抗體僅有一個(gè)抗原結(jié)合部分與組織抗原結(jié)合，剩余的抗原結(jié)合部分將與加入的金標(biāo)抗原結(jié)合，顯示某種抗原

20、的定位。但有非特異性吸附。,（4） 金標(biāo)記的其他應(yīng)用金標(biāo)記還可用于測定細(xì)胞的凝集性，結(jié)合免疫蝕刻研究紅細(xì)胞表面的抗原立體分布、血管的通透性、神經(jīng)末梢的選擇性結(jié)合、攝入和逆向運(yùn)輸、溶酶體和紅細(xì)胞的X線微量分析等。,圖 生物膜分子的流動鑲嵌模型及冷凍斷裂面圖解,（5）金標(biāo)記的定量及其分布測定細(xì)胞表面的金標(biāo)記結(jié)構(gòu)有幾種方法：諸如分光光度計(jì)，放射測定、X線分析等。由于金微粒特別是20~75 nm者，能大量吸收可見光（λmax 525~5

21、50 nm），因此可以用分光光度計(jì)測出結(jié)合在細(xì)胞表面的金微粒的數(shù)量和結(jié)合常數(shù)。如：紅細(xì)胞表面可結(jié)合16,000個(gè)大豆凝集素-Au17顆粒、結(jié)合常數(shù)為5.6x109 mol-1/L；神經(jīng)氨酸酶處理紅細(xì)胞后，每個(gè)細(xì)胞表面的金標(biāo)記物增加到42,000，但結(jié)合常數(shù)不變。其他幾種金標(biāo)記外源凝集素的結(jié)合常數(shù)大約為1010 mol-1/L左右。金微粒數(shù)量金標(biāo)記物體積,應(yīng)用實(shí)例,超順磁性鐵納米顆粒標(biāo)記對視網(wǎng)膜前體細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響,Chen

22、SY, et al. Int J Ophthalmol. 2008; 8(5): 913-915,研究背景,近年來，視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植已經(jīng)成為視神經(jīng)變性和再生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，使以往認(rèn)為無法治療的理念得以更新 。但是，干細(xì)胞移植人體后，如何從受體辨別供體干細(xì)胞，并觀察其在體內(nèi)的遷移變化情況，一直是讓人困擾的問題。MR示蹤技術(shù)在解決細(xì)胞活體示蹤的難題上是行之有效的，它有效成像時(shí)間長，可觀察細(xì)胞的動態(tài)遷徙過程，且空間、時(shí)間分辨率高，對比

23、度好 。超順磁性鐵納米顆粒（SPIO）是近年來研究發(fā)現(xiàn)的新型磁共振陰性對比劑，可在活體標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。示蹤劑的應(yīng)用是否會對供體視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化生長產(chǎn)生影響呢？,,圖1 A ：原代細(xì)胞呈球形細(xì)胞團(tuán)分布；B ：標(biāo)記成功細(xì)胞普魯士藍(lán)染色呈藍(lán)色,,圖2 A ：電鏡顯示含鐵囊泡； B ：細(xì)胞凋亡—核固縮,表1 TUNEL細(xì)胞計(jì)數(shù),圖3 MTT細(xì)胞生長活性曲線,結(jié)果：當(dāng)SPIO標(biāo)記濃度低（22.4 mg/L）時(shí)符合MRI示蹤要求，但標(biāo)記物對細(xì)