第十五章細(xì)胞工程與作物育種

1、第十五章 細(xì)胞工程與作物育種,Chapter 15 Cell Engineering and Crop Breeding,第一節(jié) 植物的細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié) 細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種第三節(jié) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交,細(xì)胞工程：（plant cell engineering）,以細(xì)胞為單位，在體外（in vitro）條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿生產(chǎn)某種

2、物質(zhì)的過(guò)程。包括花藥培養(yǎng)、體細(xì)胞變異篩選、幼胚培養(yǎng)、試管受精和原生質(zhì)體融合等。,理論基礎(chǔ),細(xì)胞的全能性（cell totipotency） ： 因?yàn)榧?xì)胞核內(nèi)有保持物種遺傳性所需要的全套遺傳物質(zhì)所以高度分化的體細(xì)胞具有發(fā)育成一個(gè)生物體的能力。,,第一節(jié) 植物的細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù),一、培養(yǎng)基及其組成,植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基主要區(qū)別在于無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)與含量。有的植物生長(zhǎng)要求無(wú)機(jī)鹽含量較高,而另一些植物則相反。,（一）培養(yǎng)

3、基的種類(lèi)和特點(diǎn),1.MS及其類(lèi)似的培養(yǎng)基2.硝酸鹽含量較高的培養(yǎng)基3.中等無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基4.低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,1.MS及其類(lèi)似的培養(yǎng)基,(1)MS培養(yǎng)基（Marshing和Shong，1962 ） MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)許多種植物均是適宜的。它的無(wú)機(jī)鹽含量和離子濃度較高，微量元素種類(lèi)較全，養(yǎng)分平衡，濃度也較高。 (2)LS培養(yǎng)基(Linsmainer和SKoog,1965) 其成分

4、是大量元素、微量元素及鐵鹽,與MS培養(yǎng)基相同,有機(jī)物質(zhì)中僅保留MS培養(yǎng)基的鹽酸硫胺素0.4mg/L及肌醇100mg/L,蔗糖3%。,(3)BL培養(yǎng)基(Botton和Lawrene,1968) 成分和MS培養(yǎng)基類(lèi)似。 (4)BM培養(yǎng)基(Button,1975) 成分與MS培養(yǎng)基類(lèi)似,僅將鹽酸硫胺素除去,蔗糖為3%。 (5)ER培養(yǎng)基(Eriksson,1965) 成分與MS培養(yǎng)基相似。,2.硝酸

5、鹽含量較高的培養(yǎng)基,(1)Bg培養(yǎng)基(Camborg等,1968) 它含有較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素,較低的氨態(tài)氮。(2)N6培養(yǎng)基(朱至清等,1975) 成分較簡(jiǎn)單，KNO3和(NH4)2SO4含量高，廣泛用于植物的花藥培養(yǎng)。(3)SH培養(yǎng)基(Scken和Hildebrandt,1972) 它是礦質(zhì)鹽濃度較高的培養(yǎng)基,其中銨與磷酸是從NH4H2P04提供的。,3.中等無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基,(1)H培養(yǎng)基(

6、Bourgin和Nitsch,1967) H培養(yǎng)基大量元素(無(wú)機(jī)鹽)是MS培養(yǎng)基的一半,微量元素種類(lèi)減少而濃度較MS高,維生素種類(lèi)則較MS多。(2)Nitsch(1969)培養(yǎng)基 與H培養(yǎng)基成分基本相同,僅生物素較H培養(yǎng)基高10倍。(3)Miller(1963)培養(yǎng)基和Blaydes(1966)培養(yǎng)基 二者成分完全相同,與MS培養(yǎng)基比較,無(wú)機(jī)元素用量減少1/3~1/2,微量元素種類(lèi)減少,無(wú)肌醇。,

7、4.低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,(1)White(WH)培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)及用量均少于MS培養(yǎng)基,約為MS的1/3。(2)WS培養(yǎng)基(Wolter和SKoog,1966) 適于進(jìn)行生根培養(yǎng)。(3)HE培養(yǎng)基(Heller,1953) 鉀鹽和硝酸鹽是通過(guò)不同的化合物來(lái)提供的。(4)改良Nitsch(1951)培養(yǎng)基 常用于花藥和胚培養(yǎng)。(5)HB培養(yǎng)基(Holley和Baker,1963)J 用于一些花卉

8、植物(如康乃馨)的脫毒培養(yǎng)效果良好。,（二）培養(yǎng)基的成分,二、培養(yǎng)基的配制,(1)水和藥品 水必須采用蒸餾水或無(wú)離子水，藥品最好采用分析純，至少是化學(xué)純藥品。(2)母液的配置 為方便培養(yǎng)基的制備，現(xiàn)將培養(yǎng)基的各種成份分類(lèi)配成濃縮的母液，正式配制時(shí)按規(guī)定用量稀釋混合。,(3)制備培養(yǎng)基 (4)培養(yǎng)基的消毒 主要有高溫高壓滅菌和過(guò)濾滅菌兩種方法。,三、無(wú)菌操作方法,（一）消毒

9、劑消毒劑 使用濃度（%） 消除難易 消毒時(shí)間（min） 消毒效果次氯酸鈉 2 易 5-30 很好次氯酸鈣 9-10 易 5-30 很好過(guò)氧化氫 10-12 最易 5-15 好溴水

10、 1-2 易 2-10 很好硝酸銀 1 較難 5-30 好氯化汞 0.1-1 較難 2-10 最好抗生素 4-50mg/L 中 30-60

11、 較好,（二）無(wú)菌操作 （三）無(wú)菌培養(yǎng),第二節(jié) 細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種,一、體細(xì)胞克隆變異及其育種利用,（一）體細(xì)胞克隆變異的遺傳基礎(chǔ)染色體數(shù)目變異染色體結(jié)構(gòu)變異點(diǎn)突變,（二）突變體的篩選,（三）在作物改良上的應(yīng)用抗病抗除草劑抗氨基酸或氨基酸 類(lèi)似物耐鹽耐旱,優(yōu)良品種,,細(xì)胞培養(yǎng),R0,,R1群體,,改良的體細(xì)胞克隆,遺傳穩(wěn)定性測(cè)試,育成新品系,區(qū)域試驗(yàn),審定,,投入生產(chǎn),,,,,,,,,田

12、間試驗(yàn),多點(diǎn)田間試驗(yàn),繼續(xù)田間試驗(yàn),種子富集,,互交測(cè)試,確定遺傳方式,利用體細(xì)胞克隆變異育種的技術(shù)路線(xiàn),二 體細(xì)胞變異體和突變體的篩選,體細(xì)胞無(wú)性系變異：植物體細(xì)胞發(fā)生的可遺傳變異變異體：不加任何選擇壓力而篩選出的變異個(gè)體突變體：經(jīng)過(guò)施加某種選擇壓力而篩選出的變異個(gè)體,有些變異發(fā)生在植株的某一部分組織的細(xì)胞中，需將這部分變異的細(xì)胞從植株上分離下來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，使之再生植株。,1 組織培養(yǎng)之前的變異及

13、其選擇,,,在組培過(guò)程中, 對(duì)培養(yǎng)物施加某種處理,使之發(fā)生變異后再進(jìn)行選擇。,2 組織培養(yǎng)期間的變異及其選擇,,,培養(yǎng)基中不含有特定的選擇因子，但含有誘變劑，由此產(chǎn)生的再生植株可能出現(xiàn)優(yōu)異變異。,3 組織培養(yǎng)后的選擇鑒定,4 體細(xì)胞無(wú)性系選擇的幾個(gè)問(wèn)題,1) 選擇目標(biāo)的確定,經(jīng)濟(jì)性狀；基因數(shù)目；顯隱性,2) 外植體的選擇,基因型、器官或組織、年齡,外植體： 用來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)的植物的某一部分組織的統(tǒng)稱(chēng),再生植株由愈傷組織直接分化而成。

14、通常,外植體先形成愈傷組織，再由愈傷組織的一部分形成類(lèi)似生長(zhǎng)錐的分化物，進(jìn)而發(fā)育成幼芽；另一部分愈傷組織則分化成幼根，這兩部分進(jìn)一步發(fā)育和聯(lián)合即形成一個(gè)新的植株。,3) 培養(yǎng)系統(tǒng)的選擇：,A 器官發(fā)生系統(tǒng)：,外植體首先形成愈傷組織，再由愈傷組織分化出類(lèi)似于種子胚的胚狀體，胚狀體進(jìn)一步發(fā)育成熟而形成完整植株。,B 胚胎發(fā)生系統(tǒng)：,4) 無(wú)性系變異的選擇,A 在大量無(wú)性系中篩選出并發(fā)變異少的個(gè)體,B 選擇兩個(gè)具有目標(biāo)性狀的無(wú)性系雜交，從

15、后代篩選出無(wú)不良變異的重組體,三 離體培養(yǎng)技術(shù)與植物育種,1 通過(guò)胚珠或子房培養(yǎng)與試管受精，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性2 使遠(yuǎn)緣雜種的胚發(fā)育成熟3 克服核果類(lèi)植物胚的后熟作用4 打破種子休眠,四 細(xì)胞與組織培養(yǎng)的其他利用途徑,1 快速繁殖2 種質(zhì)保存3 產(chǎn)生無(wú)病毒植物材料,第三節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交,植物原生質(zhì)體：指用特殊方法脫去細(xì)胞壁的、裸露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。,概 念,一 利用原生質(zhì)體制造單細(xì)胞無(wú)性系,二 植物體細(xì)胞

16、雜交（原生質(zhì)體融合）,1） 選擇合適的實(shí)驗(yàn)材料2） 酶的類(lèi)型和處理?xiàng)l件：果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等,1 原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng),3）原生質(zhì)體計(jì)數(shù),0.25 M NaNO3 和高濃度Ca2+ , 聚乙二醇（PEG）加高濃度Ca2+和高PH值，電融合技術(shù),2 原生質(zhì)體融合,關(guān)鍵是融合劑的選擇：,融合后的細(xì)胞類(lèi)型,,,3 雜種細(xì)胞的鑒別和選擇,1)用選擇性培養(yǎng)基使雜種細(xì)胞有選擇性地生長(zhǎng),2) 互補(bǔ)選擇法,3)異核體機(jī)械分離和 雜種細(xì)胞的