腫瘤的分子診斷

1、,第八 章 基因診斷Gene Diagnosis,人類疾病的原因,內(nèi)因： 基因結(jié)構(gòu)改變（基因突變）——點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴(kuò)增 基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性 基因表達(dá)異常外因： 病原體的侵入,對(duì)于疾病的診斷依據(jù)：臨床表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)： 細(xì)胞學(xué)檢查

2、 生物化學(xué)代謝產(chǎn)物和酶的活性變化檢查 免疫學(xué)檢驗(yàn) 基因診斷,一、基因診斷概述,(一) 基因診斷的概念與特點(diǎn)(二) 基因診斷的基本原理與臨床意義,(一)基因診斷的概念與特點(diǎn),1．概念： 指利用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA或RNA水平檢測(cè)基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，對(duì)疾病作出診斷的方法和過程?；蛟\斷以DNA和RN

3、A為診斷材料， DNA診斷 RNA診斷,,2．基因診斷的特點(diǎn)：,（1）直接檢測(cè)基因，屬病因診斷，針對(duì)性強(qiáng)；（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高：由于基因診斷采用核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（3）適用范圍廣：其應(yīng)用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。,基因診斷的評(píng)價(jià),特異性靈敏度重復(fù)性快速經(jīng)濟(jì),(二)基因診斷的基本原理與臨床意義

4、,1．基本原理： 通過檢測(cè)致病基因（包括內(nèi)源基因與外源基因）的存在、量的多少，結(jié)構(gòu)變化與否及表達(dá)水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。2．臨床意義: 對(duì)有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷 早期快速診斷 確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性疾病的分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等,二、基因診斷的常用技

5、術(shù)與方法,(一) 基因診斷的常用技術(shù)(二) 基因診斷的基本方法,(一)基因診斷常用技術(shù),核酸分子雜交PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）限制性酶切分析SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）DNA 測(cè)序 DNA 芯片技術(shù),基因診斷技術(shù)分類,1、Molecular hybridization： Southern, Northern, dot blot, 2、PCR3、DNA測(cè)序4、DNA芯片技術(shù),1. 核酸分子雜交M

6、olecular hybridization,Southern blot——DNANorthern blot——RNADot blot，In Situ Hybridization,,核酸雜交的基本原理：,利用核酸變性和復(fù)性理論：（1）雙鏈DNA分子在某些理化因素作用下解旋，條件恢復(fù)后又可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（2）具有互補(bǔ)堿基序列的異源核酸單鏈之間同樣可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則通過氫鍵結(jié)合為雙鏈。,核酸分子雜交的流程示意圖,待測(cè)核酸制備

7、,濾膜上核酸固化,雜 交,去除未參與雜交的探針,,,,,檢 測(cè) 雜 交 信 號(hào),制備探針核酸片段,,探 針 標(biāo) 記,,加入標(biāo)記核酸探針,,探針的種類,DNA 探針:基因組DNA探針;基因探針cDNA探針:目前應(yīng)用最廣泛的寡核苷酸探針(Oligonucleotide probes)RNA 探針:,不同的探針在應(yīng)用中有各自的特點(diǎn),但最重要的是探針的序列選擇.而探針序列又是依據(jù)待測(cè)核酸序列選擇的?！　?duì)致病性微生物應(yīng)選用其

8、最保守、最特異的序列；對(duì)突變基因的檢測(cè)，應(yīng)用含有突變位點(diǎn)的序列或待測(cè)基因編碼的ｍＲＮＡ序列。,探針的標(biāo)記物,放射性標(biāo)記物32P，35S，125I，3H非放射性標(biāo)記物生物素，地高辛，熒光素， 酶， 金屬,Southern blot,N,N T T N T T,1、Southern blot：用于DNA檢測(cè)，不但能檢測(cè)出特異的DNA片段，還能進(jìn)行定位和測(cè)定分子量，可用于基因的限制性內(nèi)切酶圖譜分析、基因突

9、變分析等。2、Northern blot：雜交用于RNA檢測(cè)，能對(duì)組織細(xì)胞中的總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析。3、dot blot：既可檢測(cè)DNA也或檢測(cè)RNA，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析。缺點(diǎn)：特異性較低，不能鑒定所分析的基因分子量。4、原位雜交：在組織、細(xì)胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位。,PCR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段合成的過程,（二）PCR技術(shù)是基因診

10、斷的一種基礎(chǔ)技術(shù),PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù),,1、直接采用PCR技術(shù)進(jìn)行基因診斷,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性的基因，可以確定病原生物基因是否存在或分析疾病相關(guān)的體內(nèi)基因缺失或基因突變,,,2、采用PCR產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）,基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成和順序發(fā)生改變，會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消失。

11、因此，突變基因經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量和大小就會(huì)發(fā)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷突變是否存在。即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)?！　CR－RFLP就是利用PCR技術(shù)先將包含待測(cè)位點(diǎn)的DNA片段擴(kuò)增出來，然后用識(shí)別該位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶水解，根據(jù)限制性片段數(shù)量和長(zhǎng)度作出診斷。,3、采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù),等位基因特異性寡核苷酸探針技術(shù)（ASO）原理： 針對(duì)已知突變位點(diǎn)的基因，可以分別針對(duì)已知

12、突變位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與無突變序列互補(bǔ)，另一個(gè)為突變型探針，與突變序列互補(bǔ)。同時(shí)設(shè)計(jì)探針時(shí)，突變堿基應(yīng)位于探針的中央，這樣在嚴(yán)格控制雜交和洗脫條件下，只有完全互補(bǔ)的探針保留下來，形成穩(wěn)定雜交分子，而中央堿基與靶序列不匹配的探針則被洗脫。,PCR/ASO則是采用PCR擴(kuò)增受檢者基因的目標(biāo)片段，并與相應(yīng)的ASO探針雜交，如果受檢者DNA擴(kuò)增的產(chǎn)物與正常探針雜交，而不與突變探針雜交，表示受檢者不存在突變基

13、因；如果只有突變探針可以雜交，說明突變基因?yàn)榧兒献?；如果兩者都存在，則說明突變基因?yàn)殡s合子。,采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù),βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探針

14、 突變探針,,,,,,4、PCR產(chǎn)物的反相點(diǎn)雜交分析技術(shù),此項(xiàng)技術(shù)與PCR/ASO技術(shù)原理完全相同，只是雜交時(shí)采用的是反相雜交。是將探針固定在膜上成為固定相，用PCR產(chǎn)物作為液體相，進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。,單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。DNA經(jīng)變性形成單鏈后，在中性條件下單鏈DNA會(huì)因其分子內(nèi)堿基之間的相互作用，形成一定的立體構(gòu)象。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA會(huì)因分子內(nèi)堿基

15、組成或排列順序不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。對(duì)長(zhǎng)度相同而構(gòu)象不同的單鏈DNA在非變性聚丙烯胺凝膠電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率。,5、采用PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析進(jìn)行基因診斷,PCR-SSCP技術(shù)就是利用PCR擴(kuò)增目的基因片段，通過變性成為單鏈，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸的改變會(huì)造成DNA片段構(gòu)象的改變，其遷移率也會(huì)改變，從而檢測(cè)基因的突變。,該技術(shù)是先制備濃度從低到高的變性劑的凝膠，然后將待測(cè)分

16、析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，到DNA電泳到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性的位置時(shí)，DNA雙鏈分開，由于不同DNA片段的堿基組成不同，因此在凝膠中泳動(dòng)發(fā)生變性的位置不同，遷移率也不同，因此可以將相同長(zhǎng)度但堿基組成不同的DNA片段分開，從而能檢測(cè)出基因的突變。,6、采用PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳技術(shù),DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，是目前新的研究熱點(diǎn)之一。

17、 如在一般正常的細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CPG島處于非甲基化狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些區(qū)域往往呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。因此DNA甲基化研究是一熱點(diǎn)。,7、甲基化特異性PCR技術(shù),將DNA先用亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。在MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為甲基化特異性的引物（primerⅠ），一對(duì)為非甲基化的引物（primerⅡ），進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性

18、引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，最終可以確定研究DNA片段部位的甲基化情況。,甲基化特異性PCR技術(shù)（ MS-PCR ）,以上介紹的基于PCR擴(kuò)增技術(shù)建立的基因診斷技術(shù)，只能提供定性結(jié)果，即有無突變。但對(duì)基因表達(dá)異常的疾病，上述方法無法滿足需要，還需要研究其基因的表達(dá)量上的變化分析，故還可運(yùn)用PCR定量分析基因表達(dá)。PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀釋法、極限稀釋法、非競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法 、 熒光定量PCR,8、采用PCR技術(shù)進(jìn)行靶

19、核酸的定量分析,,PCR擴(kuò)增有限性-平臺(tái)期及平臺(tái) 效應(yīng)（plateau effect）,PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng),梯度（系列）稀釋法：,在擴(kuò)增檢測(cè)待測(cè)樣本的同時(shí)，擴(kuò)增一系列稀釋的已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）如果在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物/模板成線性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時(shí)擴(kuò)增的待測(cè)樣本中PCR模板的相對(duì)量.必須在擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，可作粗糙的定量分析。缺點(diǎn)：不準(zhǔn)確，影響因素多。,首先將原始模板進(jìn)行梯度稀釋;然后對(duì)

20、該稀釋系列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)定;最低的陽性樣本被認(rèn)為含有與一已知的標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列中最后的陽性樣本中相同量的PCR模板基本依據(jù)：PCR擴(kuò)增的有效起始模板分子數(shù)為104～106個(gè),改良方法：極限稀釋分析,競(jìng)爭(zhēng)性PCR：,3. DNA sequencing,DNA序列測(cè)定是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù),例：四色熒光自動(dòng)測(cè)序分析結(jié)果,,,4.DNA芯片技術(shù)DNA chips or microarray,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接

21、將大量探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜交的檢測(cè)分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）,由于在制備過程中運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)如顯微光蝕刻、顯微打印等，且常用硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片技術(shù),DNA芯片技術(shù)的概念,DNA芯片技術(shù)原理,大規(guī)模集成的固相雜交 基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)、變性和復(fù)性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段

22、作探針，檢測(cè)樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性、定量分析得出待測(cè)樣品的基因序列及表達(dá)的信息,第二節(jié)對(duì)不同疾病采用不同基因診斷的策略,人類疾病多種多樣，致病原因不同，因此在基因診斷上也有不同途徑和策略。 1、對(duì)致病基因已經(jīng)找到、發(fā)生機(jī)制清楚的疾病，可以通過直接檢測(cè)致病基因進(jìn)行基因診斷。 如：病原微生物的感染：病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌等，及與疾病有關(guān)的機(jī)體內(nèi)源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。,2、對(duì)致病基因還沒找到

23、，發(fā)生機(jī)制也沒有完全清楚，但致病基因已定位于染色體或基因組的特定區(qū)域的疾病，可以通過檢測(cè)致病基因的聯(lián)鎖遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷。 如：用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，利用該遺傳標(biāo)記與相鄰的基因在遺傳過程中分離幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖特點(diǎn)，建立了染色體基因連鎖圖，根據(jù)基因連鎖圖，通過分析連鎖基因的遺傳標(biāo)記，可判斷致病基因存在的可能性。,第二節(jié)對(duì)不同疾病采用不同基因診斷的策略,3、對(duì)多因素、多基因疾病，可以通過檢測(cè)表型克隆基因進(jìn)

24、行基因診斷。,第二節(jié)對(duì)不同疾病采用不同基因診斷的策略,如高血壓、冠心病、腫瘤、精神病、自身免疫性疾病，由于疾病發(fā)生的原因復(fù)雜，涉及多基因、多因素。因此可采用表型克隆方法來分析診斷。原理：從分析正常和異?；蚪M采用差異顯示等技術(shù)找到正常人和疾病患者之間的差異序列，進(jìn)行克隆。根據(jù)克隆的一組基因差異序列制作相應(yīng)探針，用制備的這一組探針檢測(cè)相關(guān)疾病的方法。,第二節(jié)對(duì)不同疾病采用不同基因診斷的策略,4、對(duì)一些因基因表達(dá)異常出現(xiàn)的疾病，可通過基因

25、表達(dá)的定量分析進(jìn)行基因診斷。 對(duì)與基因表達(dá)異常出現(xiàn)的疾病，可以在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)該基因的表達(dá)的mRNA量進(jìn)行分析，作出診斷。,,第三節(jié) 基因診斷的應(yīng)用前景,1.雜交基礎(chǔ)上的RFLP分析（20世紀(jì)80年代）2.PCR及其衍生技術(shù)3.基因芯片技術(shù),,,,基因診斷的發(fā)展歷史,,第三節(jié) 基因診斷的應(yīng)用前景,1.理論2.技術(shù)3.倫理,基因診斷過程中存在的問題,遺傳病的基因診斷是在基因水平上對(duì)核酸堿基序列突變的檢測(cè)，從遺傳物質(zhì)的分子水

26、平上揭示疾病的發(fā)生原因和分子機(jī)制。 遺傳病的診斷分為產(chǎn)前檢查、癥狀前診斷和癥狀后診斷。遺傳病的基因診斷是進(jìn)行產(chǎn)前檢查和癥狀前診斷的唯一選擇，也是遺傳病預(yù)防最為有效的手段。,第四節(jié)、基因診斷技術(shù)檢測(cè)遺傳病,基因診斷技術(shù)途徑：①直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷途徑；②利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間接診斷途徑。,第四節(jié) 遺傳病的基因診斷,,第四節(jié) 遺傳病的基因診斷,直接診斷：檢測(cè)已知致病基因,

27、必要條件①被檢基因的突變類型與疾病發(fā)病有直接的因果關(guān)系：②被檢基因的正常分子結(jié)構(gòu)已被確定；③被檢基因突變位點(diǎn)固定而且已知。,1.點(diǎn)突變：（1）導(dǎo)致特異性限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變,直接診斷：檢測(cè)已知致病基因,血紅蛋白病可以由血紅蛋白結(jié)構(gòu)或合成異常所致的遺傳性疾病。前者稱為異常血紅蛋白病，后者稱為地中海貧血。針對(duì)異常血紅蛋白病如鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥是由于?珠蛋白基因的第6位密碼子GAG突變成GTG，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常。對(duì)此遺傳病的基因診斷

28、可采用PCR-限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)。,鐮狀紅細(xì)胞貧血HBS-Beta株蛋白基因突變：,×,5´,3´,正常基因,突變基因,1.15kb,1.35kb,鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG,,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突變攜帶著,患者,鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,1.點(diǎn)突變：（2）無限制性酶切位點(diǎn)改變,直接

29、診斷：檢測(cè)已知致病基因,PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交等技術(shù)。PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、簡(jiǎn)易地檢測(cè)已知突變。,Β地中海性貧血基因診斷（PCR-ASO）,已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行Southern Blot 雜交/斑點(diǎn)雜交。 Normal βΑGene Probe——與正常βΑ雜交Mutation βS Gene Probe——與異常βS雜交,βΑ/βΑ βΑ

30、/βS βS/βS 正常探針 突變探針,,,,,,,1、Gene 缺失遺傳病的診斷,1）α地貧的Gene診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1

31、～4個(gè)。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個(gè)α Gene時(shí)可得到10kb片段。,,,,,,,,,,,BamHI,BamHI,α2,α1,α2,,,,,10 kb,,,,14 kb,,probe,以αGene為探針，Southern blot 方法檢測(cè),αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - - 正常 缺1 缺2

32、 缺3 缺4,,,,14kb,10kb,,,,,,,,,直接診斷：檢測(cè)已知致病基因,在DNA序列上有較長(zhǎng)一段序列的重新排布。包括大片段（數(shù)十個(gè)堿基甚至數(shù)千個(gè)堿基）的丟失、插入、取代、復(fù)制放大和倒位等，這些突變進(jìn)而引起更大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)上的改變從而影響多個(gè)基因的功能，即染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等,2.基因重排\缺失 ：核酸分子探針雜交與PCR,（1）Southern 印跡雜交、斑

33、點(diǎn)雜交、原位雜交，通過設(shè)計(jì)一系列相應(yīng)于缺失區(qū)域的核苷酸探針，正常者出現(xiàn)雜交信號(hào)，而患者則因缺失這一區(qū)域，而檢測(cè)不到雜交信號(hào) （2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技術(shù)成功地同時(shí)擴(kuò)增了人類杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的多個(gè)基因座,直接診斷：檢測(cè)已知致病基因,杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的基因診斷,DMD是一種嚴(yán)重致死性疾病（XR），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。 病因是抗肌萎縮蛋白基因突變所致。Gene

34、 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 個(gè)Exon ，cDNA全長(zhǎng)13974bp，編碼3685 Aa，分子量427kD。 DMD 的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。,,,1. DNA Marker 2. 陽性對(duì)照 3. 孕婦 1. DNA Marker 2. 陽性對(duì)照 3. 孕婦4. 胎兒 5. 陰性對(duì)照

35、 4. 胎兒 5. 陰性對(duì)照,采用多重PCR法擴(kuò)增該基因的多個(gè)外顯子,3. 基因表達(dá)異常mRNA的相對(duì)定量分析mRNA長(zhǎng)度分析,直接診斷：檢測(cè)已知致病基因,二、遺傳病間接診斷,當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常性質(zhì)未知時(shí)，或疾病Gene本身尚未知時(shí)，主要通過Gene和遺傳標(biāo)記的連鎖分析間接地作出診斷。 連鎖分析基于遺傳標(biāo)記與Gene在染色體上連鎖， 通過對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，分析子代獲得某

36、種遺傳標(biāo)記與疾病的關(guān)系，間接推斷受檢子代是否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判斷并做出診斷。 遺傳標(biāo)記（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA序列、單核苷酸多態(tài)性等）,1 Southern blot--RFLP診斷(PKU),PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb 兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。,間接基因診斷,患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基

37、因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb 和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。,間接基因診斷,成年型多囊腎病的基因診斷,例：成年型多囊腎病——APKD，AD ，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13.3，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也

38、尚未闡明，但已證實(shí)APKD Gene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。,以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)行Southern Blot,基因組DNA,,PvuII酶切,DNA片段,,變性,轉(zhuǎn)膜,探針,,變性,,雜交,,結(jié)果分析,間接基因診斷,結(jié) 果,1 2

39、 1 2 3 4 5 5．7kb 3．4kb 2．3kb,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,結(jié)果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,說明致病基因與3.4kb片段連鎖,并按孟德爾方式遺傳.II5不含3.4kb片段,產(chǎn)前診斷正常.,遺傳疾病的基因診斷方法,基因異常

40、方法 探針、引物或限制酶 基因組DNA印跡雜交 缺失基因的探針 基因缺失 PCR擴(kuò)增 引物包括缺失或在缺失部位內(nèi) RFLP分析

41、 突變導(dǎo)致其切點(diǎn)消失的限制酶點(diǎn)突變 ASO雜交 正常和異常的ASO探針 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析（SSCP）引引物包括突變部位基因未知與疾病連鎖的多態(tài)性分析 與疾病連鎖的多態(tài)位點(diǎn) 探針或引物,腫瘤的基因診斷,腫

42、瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多種因素；發(fā)生過程呈多階段性，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，同時(shí)不同的腫瘤發(fā)生機(jī)制也不相同，因此在腫瘤的基因診斷時(shí)，無法采用統(tǒng)一的策略。,策略一、通過檢測(cè)腫瘤染色體異位及融合基因診斷,淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中,染色體異位和重排發(fā)生較為普遍.臨床上出現(xiàn)的炎癥性淋巴結(jié)腫大與淋巴瘤腫大的鑒定: 在淋巴瘤細(xì)胞中，T細(xì)胞受體（TCR）基因和IgH基因發(fā)生重排，原來相隔數(shù)百個(gè)堿基的IgH基因和TCR基因的V區(qū)和J區(qū)基因就會(huì)靠近在一起

43、，而炎癥增生性細(xì)胞內(nèi)就不會(huì)發(fā)生基因重排，故通過PCR擴(kuò)增可以鑒定之。,策略二、通過檢測(cè)癌基因和抑癌基因診斷腫瘤,癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。多數(shù)腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中都檢測(cè)到癌基因與抑癌基因的突變。用基因診斷方法：定量PCR、印跡技術(shù)、PCR-SSCP等檢測(cè)。 如ras癌基因，其激活的分子機(jī)制主要是點(diǎn)突變，因此可通過PCR-ASO、PCR-SSCP等方法。 P53基因是抑癌基因，在腫瘤組織中其常發(fā)生

44、突變而失活。因此可通過PCR-SSCP、DNA測(cè)序分析等，可檢測(cè)P53基因的突變。,策略三、通過檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒診斷腫瘤,,鼻咽癌Burkitt淋巴瘤肝癌宮頸癌,EB病毒HBV、HCV人類乳頭瘤病毒HPV,策略四、檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物基因或mRNA診斷腫瘤,腫瘤標(biāo)記物是腫瘤組織中產(chǎn)生的與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)的物質(zhì)。如腫瘤抗原、激素、酶等。因此通過特異的腫瘤標(biāo)記物基因的檢測(cè)，可以幫助對(duì)腫瘤的診斷。,肝癌—甲胎蛋白（AFP）

45、結(jié)腸癌—癌胚抗原（CEA）,基因診斷在感染性疾病中應(yīng)用,定性或定量檢測(cè)致病微生物的核酸， 已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染 的診斷。 動(dòng)態(tài)、定量地檢測(cè)病原體核酸能對(duì) 療效判斷和病情預(yù)后提供客觀的依 據(jù)。,SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷,2003年4月，香港研究者Peiris等報(bào) 告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和 病毒學(xué)研究結(jié)果證明，新冠狀病毒 可能是SARS的致病原因。 （Lancet,

46、2003, 361: 9365) 其它實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)得出相同結(jié)論。,,2003年4月，德國(guó)漢堡Bernhard- Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者 Drosten 等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)，獲得長(zhǎng)度為 300 bp的核苷酸序列。 根據(jù)這段序列，建立了檢測(cè)新冠狀 病毒的常規(guī)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。（www.nejm.com.org on April 10, 2003）,1. 血清學(xué)方法：ELISA（IgM/IgA）方

47、法能夠可靠地檢出出現(xiàn)臨床癥狀20天后SARS病人血清中的病毒抗體。某些病人在14-21天時(shí)，已經(jīng)可以檢測(cè)到抗體。2.  細(xì)胞培養(yǎng)方法：利用VERO細(xì)胞來檢測(cè)SARS病人的呼吸道分泌物和血液樣品，陽性結(jié)果則表示SARS病人感染了冠狀病毒。3. 分子生物學(xué)方法：主要是運(yùn)用PCR的方法對(duì)血液、糞便、呼吸道分泌物、痰液、唾液和漱口液等臨床樣本的核酸提取物進(jìn)行體外的擴(kuò)增后，進(jìn)行定性與定量的分析。,檢測(cè)方法,討 論

48、,疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果（早 于血清轉(zhuǎn)換期）。 特異性較高（SARS患者中的陽性 率約為80%，對(duì)照中的陰性率約為 98%~100%）。 現(xiàn)有的方法敏感性較差，陰性結(jié)果 不能排除病毒感染。,討 論,痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道 排放是主要傳播途徑。血清中檢測(cè)到極低濃度的病毒RNA，提示病毒 復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞