華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文答辯

1、博士論文答辯,草魚核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域 (nucleotide-binding oligomerization domain，NOD )基因和γ-干擾素相關(guān)基因( IFN-gamma related gene，IFN-γrel)的克隆及其表達(dá) 指導(dǎo)教師：彭克美 教 授 聶

2、 品 研究員 答 辯 人：陳文欽 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技-動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 2010年5月30日,答辯內(nèi)容,五、課程學(xué)習(xí)及文章發(fā)表情況,四、創(chuàng)新點(diǎn)及下步研究計(jì)劃,二、草魚NOD基因,三、草魚γ-干擾素相關(guān)基因,一、研究 背景,匯報(bào)內(nèi)容,

3、,,,,,1.概述 以往為人們所熟知的PRRs主要是一些膜結(jié)合蛋白如甘露糖受體、To1l樣受體、CD14和清道夫受體等，主要識(shí)別胞外環(huán)境的微生物結(jié)構(gòu)成分。最近的研究發(fā)現(xiàn)，胞漿中也存在著識(shí)別細(xì)菌和病毒成分的PRRs——核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白。,一、研究背景,2.NOD蛋白的組成和結(jié)構(gòu) 通過對(duì)人類基因數(shù)據(jù)庫同源搜索，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)成員： NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15

4、)、NOD3-NOD5、 NALP1-14 、IPAF、CIITA、NAIP等。 NOD 蛋白主要由三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成：（1）LRR：是富含亮氨酸的重復(fù)序列，位于C端（2）NACHT：位于中央，對(duì)于NOD蛋白的寡聚體化和活化非常重要。（3）效應(yīng)結(jié)構(gòu)域：位于N端，可以是1個(gè)PYD，1個(gè)或2個(gè)CARD ，或者是3個(gè)BIR。,一、研究背景,NOD家族的結(jié)構(gòu)示意圖,一、研究背景,3.NOD的識(shí)別作用 已有研究表明，

5、NOD1和NOD2是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌肽聚糖的感受器，能識(shí)別細(xì)菌肽聚糖(PGN) 的降解產(chǎn)物。NOD1 識(shí)別的最小結(jié)構(gòu)是革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)物內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid , meso-DAP) ；NOD2 識(shí)別細(xì)菌的最基本結(jié)構(gòu)是PGN 的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。MDP 幾乎存在于所有細(xì)菌的PGN 中，因此，NOD2 既是G+細(xì)菌也是G-細(xì)菌的感受器。,一、研究背景,4.N

6、OD 蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 在非活化狀態(tài)，NOD1、NOD2 的LRR 和NACHT結(jié)合保持分子處于折疊狀態(tài)。當(dāng)NOD1 和NOD2通過LRR 和配體結(jié)合后可以打開，通過NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD 和下游RICK分子的CARD 結(jié)構(gòu)域發(fā)生嗜同種結(jié)合，活化RICK。經(jīng)過復(fù)雜的磷酸化，活化NF- κB，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄以及抗菌肽的合成。,一、研究背景,NODs介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路圖,5.NOD蛋白的生物學(xué)功能

7、 NOD蛋白主要的生物學(xué)功能是加強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)探測(cè)微生物感染的能力，產(chǎn)生IL-1β等促炎因子，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。近來的研究發(fā)現(xiàn)NOD蛋白除了識(shí)別細(xì)菌產(chǎn)物外，還可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、直接參與細(xì)菌感染的控制。現(xiàn)在也有最新報(bào)道，證明NOD蛋白也在抗病毒免疫中起著重要作用。,一、研究背景,6.選題的目的與意義 盡管對(duì)哺乳動(dòng)物胞內(nèi)模式識(shí)別受體在參與對(duì)細(xì)菌的識(shí)別、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用等方面進(jìn)行了深入的研究

8、，但國內(nèi)外對(duì)魚類NOD基因的研究?jī)H有2篇報(bào)道。迄今為止，對(duì)魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的特征以及是否具有類似于哺乳動(dòng)物的功能還是不清楚的。本論文擬通過對(duì)草魚NOD1和NOD2基因的克隆以及表達(dá)分析，旨在揭示魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特征。同時(shí)該研究為進(jìn)一步研究NODs基因的功能奠定了基礎(chǔ)。,一、研究背景,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,1. gcNODs基因的分子特點(diǎn)1.1 gcNOD1: cDNA包含32

9、15bp，ORF區(qū)域?yàn)?813bp，大約編碼937個(gè)氨基酸, 5′-UTR為350bp， 3′-UTR為52bp 。 C端的LRR結(jié)構(gòu)域，位置在769-791、825-851；N端有一個(gè)CARD，結(jié)構(gòu)域在11-73； NOD1的NACHT結(jié)構(gòu)域在186-359。,1.2 gcNOD2: cDNA全長3130bp，編碼982個(gè)氨基酸； ORF為2949bp，編碼982氨基酸，5′-UTR為81bp， 3′-UTR為10

10、3bp， C端LRR有7個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)域；N端有兩個(gè)CARD，結(jié)構(gòu)域在27-81、111-200；中間NACHT結(jié)構(gòu)域在271-441。,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,草魚NOD1,草魚NOD2,草魚NODs基因的結(jié)構(gòu)示意圖,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,2. gcNODs基因的基因組結(jié)構(gòu),草魚NOD1基因組全長9kb,由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成,草魚NOD2基因組全長5kb,由

11、10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,3. gcNODs基因的內(nèi)含子相位,表1.草魚、斑馬魚以及人NODs基因內(nèi)含子相位,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,4. gcNODs基因與其他物種NODs基因的氨基酸相同/相似性比較,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,5. gcNODs基因的分子進(jìn)化樹,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,6. gcNODs基因在不同組織中的組成性表達(dá),二、gcNODs基因

12、的克隆與表達(dá)分析,7. gcNODs基因在肽聚糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá),二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,*,*,*,*,*,8. gcNODs基因在脂多糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá),二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,*,*,*,*,*,*,9. gcNODs基因在Poly I:C刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá),二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,10. gcNODs基因在呼腸孤病毒感染下的誘導(dǎo)型表達(dá),*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,

13、*,*,*,*,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,11. gcNOD1基因重組蛋白的表達(dá)與純化,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,11. gcNOD1基因重組蛋白的表達(dá)與純化,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,12. gcNOD1蛋白的免疫組化,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,13.小結(jié)（1）首次從魚類中克隆了NOD1和NOD2基因，氨基酸的排列、基因組結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子相位的分析都顯示了NOD1和NOD2在進(jìn)化上具有很

14、強(qiáng)的保守性；（2）熒光定量分析顯示草魚的NOD1和NOD2基因呈廣泛的組成性表達(dá)分布，在所檢測(cè)的組織中都可以檢測(cè)到表達(dá)；,二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析,（3）來自革蘭氏陽性菌的PGN對(duì)草魚NOD1的表達(dá)在大多數(shù)組織中沒有顯著的作用；（4）在LPS刺激下，gcNOD1的誘導(dǎo)表達(dá)特征與gcNOD2相似；（5）polyI:C和病毒感染也能誘導(dǎo)gcNOD1和gcNOD2的表達(dá)。,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,1.

15、 gcIFN-γrel基因的分子特點(diǎn) IFN-γrel基因的cDNA包含861bp， 其中5?- UTR長39 bp，ORF長504bp編碼167個(gè)氨基酸，3?- UTR長316bp。 3?- UTR富含AT（75.2%），一個(gè)潛在的多腺苷酸加尾信號(hào)（AATAAA)位于poly[A]尾上游13bp。,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,AAATTCGCTTGGTTCACAGCACCAAAACACAAACAC

16、AAAGAATGGATTCTTGGCTCAACA M D S W L NTGATGCTGCTGTGTGGACTTCTGTTAATAGCATCTCTTCAGACAACCAACGCTTTCAGATM M L L C G L L L I A S L Q T T N A F R TTCG

17、ACGGTCCAAAAGCGAGATGACCCATTTGGAGACAAATATCCACTCTCTGCAAGAACF R R S K S E M T H L E T N I H S L Q EATTATgtaagtgatgtctactatcatgaacttcagcagggggtttgaaagcaactcttgtH Y ctgtgttaacaagatgaatcacttcaagtcctactc

18、atatctgtatgttatagtttggtcttgcggctaatattagcaagaagagacctattgcacaataaatttcacgaaactttgttcttagattaggagttaagattcaccagagatgcacattcattcataacgtttgctgttttttgcccgctttctttagAAAACACGTGGCACAGAATGGGTTTCAAAGTCTGTTTTTGTTCC

19、 K T R G T E W V S K S V F V PTCATCTGAACCAGCTGAATgtaagtttttactgtgcaaaatgctaaaatattaaaatgca H L N Q L N actgaatgatatatatgcctctatatatgtatcatgctaataatacttgtttctcttagTCCAAGGCTTCCTGCACTTGTCAGGCGCTGT

20、TGCTTGAAAGAATGCTGAACATCTACGAAGS K A S C T C Q A L L L E R M L N I Y E AACTTTTCCAAGACATGAAGTCTGAGCATAAAGAAGGGAGAAAAGATCTAGACCATCTAAE L F Q D M K S E H K E G R K D L D H L TGGATG

21、AGGTGAAAAAGCTGAGGGGAAATTATAAGGAAGAACATAAAGTATGGAAAGAGCM D E V K K L R G N Y K E E H K V W K ETTCAGGAAATGAACTCAGTCAAGgtaaacattaagagaaagtcctgtcttcattgtgaatL Q E M N S V K gtgtacattttgagttattga

22、attgctgtttatcatatgatatcaggtcaggtgatataatatatgatatggtactgtatctaatacaaatatttgtcctcactctcacaagGTGAAAAA V KTGGAACAATCCGAGGAGGAGCATTAAATGACTTTCTCATGGTGTTTGATCGGGCCTCTAC

23、N G T I R G G A L N D F L M V F D R A S AGAAAAACACAAAAAGGTTCAATGAGAAGATCCAAAAGTCATGTCTTTCATTTAGTAAACT E K H K K V Q *TTGCGCTTTGTTATTGTGTTAGCCTATTTATTTATAAATTATATGGAAATAATTATTTATTTTTAACTTTA

24、TAATGTACTCTACTACACCATCCATAACTTATAATCTAACTTATTCTCATCACAAGTGTGTTTGCATCATTTACAGTGTACAGAAACGATGAACGTTGATTTCTAACTGGATTTGCTTGAAATATTCTGTGAGCTTCACTGGCTAAATGTTTAATTACAATAAATTAATTTTGCATTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA,草魚γ-干擾

25、素相關(guān)基因的cDNA與基因組序列,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,2. gcIFN-γrel基因與其他物種γ-干擾素與γ-干擾素相關(guān)基因同源性比較,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,3. gcIFN-γrel基因與其他硬骨魚類γ-干擾素與γ-干擾素相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,4. gcIFN-γrel基因的組織表達(dá),三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,

26、5. gcIFN-γrel基因在脂多糖和PolyI:C刺激下的誘導(dǎo)性表達(dá),三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,6. PGN的刺激對(duì)草魚IFN-γrel、NOD1和NOD2表達(dá)的影響,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,7. gcIFN-γrel基因在呼腸孤病毒感染下的誘導(dǎo)型表達(dá),*,*,*,*,*,*,*,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,8.小結(jié)(1)序列分析顯示本研究所克隆的gcIFN-γre

27、l基因是一個(gè) 與斑馬魚、鯰魚和鯉魚中IFN-γrel基因同源的基因，而不是那個(gè)早已存在的IFN-γ基因；(2)與哺乳類和鮭鱒的IFN-γ不同的是，從20條不同來源的草魚的序列分析顯示，gcIFN-γrel在它的內(nèi)含子中缺乏多態(tài)性微衛(wèi)星序列；,三、gc IFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析,(3) gcIFN-γrel呈廣泛的組成性表達(dá)；(4)聚肌胞甘酸(polyI:C)，一種模擬病毒雙鏈RNA而合成的dsRNA，能上調(diào)gcIFN-γ

28、rel基因的表達(dá);(5)在所分析的四個(gè)組織中， gcIFN-γrel 的表達(dá)規(guī)律與gcNOD2相一致；推測(cè)IFN-γ和IFN-γrel被細(xì)菌的產(chǎn)物PGN所激活可能是通過NOD2依賴的方式。,四、創(chuàng)新點(diǎn)及下步研究計(jì)劃,1.主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) （1） 首次從草魚中克隆了胞內(nèi)識(shí)別細(xì)菌的模式識(shí)別受體NOD1和NOD2基因的cDNA全長和基因組全長；（2） 對(duì)草魚胞內(nèi)模式識(shí)別受體NOD1和NOD2從mRNA水平、蛋白水平及細(xì)胞水平進(jìn)行了表達(dá)或定位分

29、析；同時(shí)，首次研究了病毒的感染對(duì)細(xì)菌模式識(shí)別受體NOD1和NOD2基因表達(dá)的影響；（3） 克隆了草魚IFN-γ相關(guān)基因的cDNA全長和基因組全長，并對(duì)該基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究；首次提出了草魚IFN-γ相關(guān)基因與NOD樣模式識(shí)別受體在發(fā)揮功能上存在相關(guān)性。,2.下步研究計(jì)劃 （1）研究NOD樣模式識(shí)別受體對(duì)細(xì)菌成分的識(shí)別以及在病毒感染中的作用；（2）研究NOD樣模式識(shí)別受體在激活下游的NF-κB的信號(hào)通路的作用；（3）研究IFN-

30、γ與NOD樣模式識(shí)別受體的協(xié)同作用。,四、創(chuàng)新點(diǎn)及下步研究計(jì)劃,五、課程學(xué)習(xí)及論文發(fā)表情況,1.課程學(xué)習(xí)情況 學(xué)位課 11個(gè)學(xué)分 非學(xué)位課 3個(gè)學(xué)分共計(jì) 14個(gè)學(xué)分,2.發(fā)表論文情況 Chen WQ (陳文欽), Xu QQ, Chang MX, Nie P, Peng KM. Molecular characterization and expression analysis of n

31、uclear oligomerization domain proteins NOD1 and NOD2 in grass carp Ctenopharyngodon idella. Fish Shellfish Immunol. 2010 Jan; 28(1):18-29. Chen WQ（陳文欽）, Xu QQ, Chang MX, Zou J, Secombes CJ, Peng KM, Nie P. Molecular cha

32、racterization and expression analysis of the IFN-gamma related gene (IFN-gammarel) in grass carp Ctenopharyngodon idella. Vet Immunol Immunopathol. 15;134(3-4):199-207.,,五、課程學(xué)習(xí)及論文發(fā)表情況,致 謝,衷心地感謝： 兩位導(dǎo)師—彭克美教授和聶品研