凝血檢測及質(zhì)量保證

1、凝血檢測及質(zhì)量保證,嘉魚縣人民醫(yī)院姚和平,,,,,概要,一 凝血基礎理論二、凝血實驗檢測三 凝血檢測的質(zhì)量控制,血管中流動的血液為什么不凝固破損的血管為什么能止血機體凝血與抗凝血功能平衡是機體的重要的防御功能之一。這種平衡是以血漿成分（凝血與抗凝纖溶相關因子）的正常，血細胞量和（或）質(zhì)的正常，血管結構和功能正常以及血液流變學的正常為基礎得以維持。正常機體止血包括三個過程：1.血管收縮、2.PLT激活、黏附、聚集形成血小板血

2、栓.3.啟動凝血。凝血系統(tǒng)激活的同時，抗凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)也被激活?？鼓到y(tǒng)的激活．可防止凝血過程的擴散。正常機體的凝血、抗凝血、纖溶系統(tǒng)之間，處于動態(tài)的平衡。,機體內(nèi)存在著復雜的凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng),,,,,,凝血血栓,抗凝出血,,一 凝血基礎理論,,正常止血機能,兩方面,五因素,凝血機制,抗凝機制,血管壁,血小板,凝血系統(tǒng),抗凝系統(tǒng),,,,正常止血機制,纖溶系統(tǒng),1、血管壁的作用,血管受損 血管收縮(1)

3、 止血 血液粘稠(4) 止血 內(nèi)皮細胞 PLT黏附聚集(2) 止血 TXA2 5-HT

4、 釋放暴露內(nèi)皮下膠原 激活Ⅻ(3) 內(nèi)源性凝血 止血 TF釋出 外源性凝血 止血,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,神經(jīng)反射,內(nèi)皮素 血管緊張素,vWF,,,Vascular injury,,,,,,,,,,,,,,,,Fg＆Ca2+,platelet,TF,Ⅶa-TF - Ca2+,FIBRIN CLOT,

5、Fibrinogen,,,,,,1、血管壁的作用,血管受損 vWF 血小板黏附（1） PLT聚集(Ⅰ)（2） Fg PLT釋放(5-HT ADP)（3） GP IIb/IIIa Fg 血管 加速 (Ⅱ） 加速Ⅱa 使纖維蛋白 收

6、縮 聚集 形成（2） 網(wǎng)收縮（4） 血小板產(chǎn)生釋放反應參與二期止血,,,,,,,,,,2、血小板的作用,Vascular injury,,2、血小板的作用,粘附,聚集,釋放,Ⅰ 纖維蛋白原Ⅱ 凝血酶原Ⅲ 組織因子Ⅳ 鈣離子Ⅴ 易變因子Ⅵ 不存在Ⅶ 穩(wěn)定因子 Ⅷ 抗血友病因子Ⅸ Christmas因子Ⅹ Stuart-Pow

7、er因子Ⅺ 血漿凝血活酶前加速素Ⅻ Hegeman因子XIII 纖維蛋白穩(wěn)定因子PK 激肽釋放酶原HMWK 高分子量激肽原,目前公認的凝血因子共14個，按羅馬字命名的有12個，及高分子量激肽原(HMWK)，激肽釋放酶原(PK)大多數(shù)由肝臟產(chǎn)生，其中II、VII、IX、X合成依賴Vitk，稱Vitk依賴因子除TF外，都存在于血漿，是凝血反應的重要啟動因子除FIV（Ca2+）外均為蛋白質(zhì)正常情

8、況下，所有因子都處于無活性狀態(tài),3、凝血因子,凝血機制（瀑布學說）,,,,Intrinsic pathway,extrinsic pathway,common pathway,,,,,,,,,,,,ⅩⅢ,,,,,,,,,,,,,K,PK,,,HMWK,三個階段凝血酶活酶形成凝血酶形成纖維蛋白形成,兩途徑,正常的止血凝血機制,,4 、抗凝系統(tǒng),抗凝血酶系統(tǒng) ：AT-Ⅲ，肝素 --凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含絲氨酸的

9、蛋白酶的抑制劑絲氨酸蛋白酶抑制劑，能滅活Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa、Ⅻa及凝血酶。蛋白C系統(tǒng)：蛋白C、蛋白S、血栓/凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM) --使凝血因子Va, VIIIa失活; --TM與凝血酶結合，促凝轉(zhuǎn)向抗凝IFPI 組織因子途徑抑制物 （組織因子旁路抑制因子 ） --抑制VIIa/Xa,抗凝系統(tǒng)作用,AT-Ⅲ TFPI 肝素Ⅱa Ⅸa

10、 Ⅹa Ⅺa Ⅻa K Ⅴa Ⅷa TF/Ⅶa肝素輔因子Ⅱ(Hc-Ⅱ) APC +PS 激活纖溶 Ⅱa/TM PC,,,,,,,,,,,,,,（肝和內(nèi)皮細胞合成）,TFPI—組織因子途徑抑制物AT-Ⅲ—抗凝血酶ⅢPc、Ps

11、TM—血栓調(diào)節(jié)蛋白,,Ca2+,分解清除纖維蛋白（原），保持血流通暢組成 纖溶酶原（plg） 纖溶酶（pln） 纖溶酶原激活物(PAs） 纖溶酶原激活物抑制物 (PAIs) 纖維蛋白原(Fbg) 纖維蛋白(Fbn) 　 纖蛋白原降解產(chǎn)物 FDP,5、纖維蛋白溶解系統(tǒng)(纖溶),纖溶系統(tǒng),纖溶酶原激活物t-PA u-PA Ⅻa K Ⅱa

12、 （+） 纖溶酶原 纖溶酶 PL 纖溶酶抑制物 （+） 水解 ⅧⅨⅩⅪⅫ XⅢ纖維蛋白及 纖維蛋白纖維蛋白原 降解產(chǎn)物

13、 D-D等,,,,,,,,PLG,,血小板聚集,（-）,（-）,,二個階段纖溶酶原激活---纖維蛋白降解,外激活途徑,內(nèi)激活途徑,最重要的生理性抗凝系統(tǒng),纖維蛋白原 纖維蛋白單體 穩(wěn)固纖維蛋白 纖溶酶 纖溶酶 纖溶酶 Bβ1-42 Bβ15-42 D二聚體、多聚體A、B、C、H A、B、C、H

14、X、Y、D、E X’、Y’、D’、E’ X’、Y’、D’、E’  被降解的纖維蛋白（原）產(chǎn)物統(tǒng)稱為FDP,,,,,,止凝血障礙性疾病的發(fā)病機制,當機體各種凝血因子、抗凝因子、纖溶因子的數(shù)量發(fā)生變化或功能產(chǎn)生障礙：血管結構或功能發(fā)生異常，特別是血管內(nèi)度細胞的結構和功能異常；以及血細胞，特別是血小板的質(zhì)或量發(fā)生異常等，均可使凝血與抗凝血功能紊亂一在臨床上出現(xiàn)血栓形成傾向或出血傾向．甚至發(fā)生出血或血

15、栓形成性疾病。,止凝血障礙性疾病的發(fā)病機制,血管壁結構與功能異常血小板質(zhì)與量異常凝血因子質(zhì)與量異常循環(huán)中抗凝物質(zhì)增加纖溶系統(tǒng)異常綜合因素,一期止血缺陷,二期止血缺陷,纖溶系統(tǒng)缺陷,,,,止凝血障礙與各種常見病,血液系統(tǒng)疾病心血管疾病糖尿病腎臟疾病婦產(chǎn)科疾病外科手術體外循環(huán)等,心肌梗死,凝血功能異常,,二、凝血障礙的實驗檢測,凝血障礙的實驗檢測血管壁的檢查血小板數(shù)量和功能的檢查血小板數(shù)量：血小板計數(shù)、形態(tài)血小

16、板功能：血小板粘附、聚集血小板相關抗體凝血因子 內(nèi)源性：APTT測定外源性：PT測定因子活性測定抗凝蛋白測定：AT-Ⅲ測定，PC測定 纖溶系統(tǒng)檢查：FDP,D二聚體，3P試驗,（一）血管壁檢測,初篩試驗出血時間測定（BT）傳統(tǒng)方法有Duke法和 IVy 法目前推薦使用標準化出血時間測定器法（TBT ）（出血時間測定器測定法）：2.5～9.5min（>10min為延長）。束臂試驗又稱毛細血管抵抗力試

17、驗，或毛細血管脆性試驗 （CFT） 診斷試驗血管性血友病因子檢測,診斷試驗－－血管性血友病因子檢測,血管性血友病因子（活性/抗原檢測） 免疫火箭電泳法 酶聯(lián)免疫法臨床意義減低：血管性血友?。╒WD）增高：血栓性疾病,（二）血小板檢測,血小板計數(shù)血塊收縮試驗血小板功能血小板粘附試驗血小板聚集試驗血小板相關免疫球蛋白,診斷試驗－－血小板聚集試驗,參考值：臨床意義：增高：血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如急性心

18、梗，心絞痛，腦血管病，深靜脈血栓形成，口服避孕藥等減低：血小板無力癥，原發(fā)及繼發(fā)血小板疾病，血管性血友病，應用抗血小板藥等,診斷試驗－血小板相關免疫球蛋白（pAIg）,血小板相關免疫球蛋白 又稱血小板相關抗體pAIg增高－－免疫性血小板減少的共同特征自身抗體（最多90%）－如ITP、SLE、類風濕同種抗體－－如大量輸血或血小板、新生兒免疫性血小板減少癥免疫復合物相關抗體－藥物性、敗血癥及AIDS等,（三）凝血因子檢測,凝血時

19、間（CT）活化部分凝血活酶時間(APTT)凝血酶原時間(PT)纖維蛋白原(FIB)凝血酶時間(TT),,初篩試驗－－活化的部分凝血活酶時間（APTT）,臨床意義,延長：內(nèi)源因子缺陷(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)：血友病A、B，因子XI缺乏 共同因子缺陷：FV、FX、凝血酶原、纖維蛋白原?嚴重肝病、DIC 循環(huán)中抗凝物質(zhì)增多普通肝素應用的首選指標－使APTT延長1.5-2.5倍縮短：高凝狀態(tài)－腦血栓、心梗、DIC高凝期,初篩試驗－

20、－血漿凝血酶原時間（PT）,世衛(wèi)組織將人腦凝血活酶標準品作為制備不同來源凝血活酶的參考物，ISI表示標準品與每一批凝血活酶PT校正曲線的斜率，越小試劑越敏感,臨床意義,延長：先天性凝血因子異常：Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ因子缺乏后天性凝血因子異常：嚴重肝病、VitK缺乏、纖溶亢進、DIC后期、使用抗凝藥物如雙香豆素縮短：DIC、心梗、腦血栓、血栓性靜脈炎、MM、乙醚麻醉后,血漿凝血酶時間（TT）,原理：血漿+凝血酶→纖維蛋白形成16－

21、18s－超過正常對照3s為延長,,,血漿,標準凝血酶,,,,,延長：纖維蛋白原質(zhì)與量異常FDP增多，如纖溶亢進循環(huán)抗凝物質(zhì)增多，如AT-Ⅲ、肝素樣物質(zhì) 異常球蛋白增多，如MM,,纖維蛋白原測定,減低：肝臟疾病 原發(fā)性纖溶亢進 低或無FIB血癥 溶栓治療等增高：血栓前狀態(tài)或血栓性疾?。?急性心梗、腦梗 糖尿病、妊高征 外科手術后 多發(fā)性骨髓瘤等,診斷試驗

22、－－凝血因子活性/抗原測定,增高:血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如肺栓塞、妊高征、晚期妊娠、腎病綜合征、惡性腫瘤等 減低: FⅧ∶C減低－血友病A、vWD、FⅧ抗體、DIC FⅨ∶C減低－血友病B、肝臟病、維生素K缺乏癥、DIC、口服抗凝藥物FⅪ∶C減低－因子Ⅺ缺乏癥、肝臟疾病、DIC等,（四）抗凝血功能檢查,血漿抗凝血酶Ⅲ活性(AT-Ⅲ:A)　臨床意義增高: 血友病、白血病和再障等急性出血期及口服抗凝藥物治療中。減低: 先天

23、性和獲得性AT-Ⅲ缺乏癥 血栓性疾病、DIC和肝臟疾病等血漿蛋白C活性測定　臨床意義減低：先天性或獲得性PC缺乏癥 DIC、肝病、手術后、口服抗凝劑、急性呼吸窘迫綜合征,,,（五）纖溶系統(tǒng)檢查,血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物D-二聚體測定3P試驗,血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）,臨床意義：繼發(fā)性纖溶增強，如DIC、嚴重感染、惡性腫瘤、大手術后、深靜脈血栓、肺梗塞、溶栓治療期原發(fā)性纖溶時FDP亦顯著增高,原

24、理：膠乳比濁法,D-二聚體測定（D-dimer）,－－交聯(lián)纖維蛋白降解的特異產(chǎn)物參考范圍：20－400μg／L ＞500μg／L 有臨床意義,臨床意義深靜脈血栓、肺梗塞、繼發(fā)纖溶亢進(DIC)--D-D顯著增高凡有血塊形成的出血－－增高D-D正常--排除深靜脈血栓形成DIC--常>2000μg/L以上，敏感性可達100%溶栓治療：溶栓治療時FDP和D-D增高　　　　　　溶栓完全后D-D下降，但

25、FDP并不下降原發(fā)性纖溶亢進－－D-D不增加,血漿魚精蛋白副凝試驗（3P試驗）,原理與方法,,陽性--FDP、FM增多－DIC/繼發(fā)性纖溶亢進 溶栓治療后大出血（創(chuàng)傷、手術、咯血、嘔血），惡性腫瘤、人工流產(chǎn)等原發(fā)性纖溶、DIC晚期－－陰性,彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的檢測,定義：多種致病因素導致全身微血管內(nèi)微血栓的形成，消耗大量的血小板和凝血因子，并引起繼發(fā)性纖溶亢進，造成血栓—出血綜合征實驗室檢測：(同時有三項以上的異常)

26、)血小板計數(shù)(＜100×109／L或進行性下降)血漿纖維蛋白原含量(＜1.5g/L或進行性下降或＞4g/L)3P試驗陽性或FDP＞20mg/L或D-二聚體水平升高或陽性PT縮短或延長3秒以上(肝病延長5秒以上)或呈動態(tài)變化APTT縮短或延長10秒以上纖溶酶原含量及活性減低＜200mg/LAT－Ⅲ含量及活性降低＜60%或蛋白(PC)活性減低,Overt-DIC評分系統(tǒng),是否有引起DIC的基礎疾病,評分,停止,否,

27、是,,D- dimer增加 　　　正?；蚵栽黾?檢測項目的選擇和應用,一期止血缺陷的選擇：BT、PLT二期止血缺陷的選擇：PT、APTT纖維蛋白溶解綜合征：FDP、DD血栓前狀態(tài)抗栓治療的監(jiān)測：肝素：APTT 口服抗凝劑：PT 溶栓治療：DD等,檢查項目的選擇及應用,為血管和血小板缺陷所致的疾病,一期止血缺

28、陷(血管損傷小),,,,,檢查項目的選擇及應用,內(nèi)源：Ⅷ Ⅸ Ⅺ外源：Ⅶ 共同：ⅩⅤⅡⅠⅩⅢ,,二期止血缺陷(血管損傷較大),,,,,檢查項目的選擇及應用,抗凝治療的實驗室監(jiān)測抗凝療法－－阻止血液凝固，防治血栓栓塞性疾病廣義的抗凝包括：預防血栓形成的藥物療法若已形成血栓－－溶栓治療肝素：首選APTT(1.5－2.5倍)；血小板計數(shù)華法令：首選PT，以INR(國際標準化比值) 2.0－2.5,＜3為界抗血小板藥－－口服有

29、效，可長期服用，療效持久、確切，一般無出血危險，故無需常規(guī)進行實驗室監(jiān)測－－必要時監(jiān)測血小板聚集功能,小劑量即50mg或75mg，q12h，無需監(jiān)測,應用Warfarin時INR值的允許范圍,三 凝血檢測的質(zhì)量控制,定 義,質(zhì)量保證(Quality Assurance,QA) 為一產(chǎn)品或服務滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。 室內(nèi)質(zhì)量控制（I

30、nternal Quality Control,IQC) 由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。,定 義,室間質(zhì)量評價 （ EQA） 為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機構，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結果，使各實驗室之

31、間的結果具有可比性。這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定在實時的測定結果的可接受性。當EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒炇艺J證的目的而評價實驗室操作時，常描述為實驗室能力驗證（Proficiency testing, PT）。在以前的文獻中，EQA常描述室間質(zhì)量控制。,定 義,批 (Run)在相同條件下所獲得的一組測定。 均值（Mean） 標準差（SD或s )變異系數(shù)（CV）,定 義,正態(tài)分布 當一質(zhì)控物用同一方法在

32、不同的時間重復多次測定，當測定數(shù)據(jù)足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應測定值的個數(shù)，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。,定 義,正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學含義可用均數(shù)（）、標準差（s）和概率來說明。,質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評之間的關系,實驗室質(zhì)量管理體系的建立,質(zhì)量手冊 質(zhì)量體系程序文件標準操作程序 (相關記錄表,

33、質(zhì)量管理的內(nèi)涵,寫你所做的做你所寫的記錄你已做的分析你已做的,分析你已做的,每次實驗結果的分析 表象與真象多次實驗結果的綜合分析 趨勢的內(nèi)在含義儀器設備的使用情況分析 維護與校準周期的有效性,分析前質(zhì)量控制,標本的采集1 時間：清晨空腹，病人服藥情況2 采集容器3 技術要點：止血帶壓力束縛時間 采血順利 避免組織因子污染溶 血 凝血氣泡產(chǎn)生。4 顛倒混勻，避免用力振蕩破壞凝血蛋白,抗

34、凝劑的選擇與使用1 抗凝劑的比例2 充分混勻，避免氣泡產(chǎn)生及自身污染3 血細胞比容的影響： 嚴重貧血者(Hct0.55) 調(diào)整比例：用量(ml)＝0.00185×全血量(ml)×(1-Hct),分析前質(zhì)量控制,標本的保存與處理1 溫度： 4或20℃，全血室溫放置不超過2小時2 血漿分離：最好1小時之內(nèi)1h內(nèi)分離血漿，4h內(nèi)測定完畢, 4℃冰箱保存，最多不能超過6h .3 冷凍血漿：37℃水

35、浴中快速解凍，不能再次冷凍4試管加塞5分離血漿用塑料吸頭6離心的時間和速度時間短，速度低，血漿中的PLT會影響測定,分析前質(zhì)量控制,-20℃--2周-80℃--18個月,,分析中質(zhì)量控制,實驗人員規(guī)范操作,室內(nèi)質(zhì)控,,,,試劑,,儀器,,,,分析中質(zhì)量控制,分析中質(zhì)量控制,儀器 血凝儀分類:按測量原理可分 光學濁度法 分散射 吸光度增加為終

36、點吸光度降低為終點 透射兩 磁珠法 光電探測法 電磁探測法(雙磁路磁珠法) 注意事項：1 .環(huán)境 2 .調(diào)試與校準 (校準的要求校準的頻率)3. 參數(shù)的設置 4. 準確度 攜帶污染率 5. 保養(yǎng)和維護.,儀器的質(zhì)量保證,儀器的安裝環(huán)境 儀器的調(diào)試與校正 與儀器匹配的校正液，合理的校正點及校正參數(shù).參數(shù)的設置 要準確、合理　如試劑量、樣本量、孵育時間、激活時間、反應溫度 .儀

37、器的質(zhì)量　準確度：PT、APTT：均值±15%，F(xiàn)IB：均值±25%。精密度：批內(nèi)，PT<2%，APTT<3%，F(xiàn)IB<5%；批間，PT<3%,APTT<3%,FIB<6%；日間，PT<4%，APTT<5%,FIB<7%。攜帶污染率等指標要符合要求。及時正確地保養(yǎng)和維護 儀器溫度、波長，特別是對光源燈要定期檢查、校正，避免因光源燈光學性能衰減對測定的影響。同

38、時要保持機械和光學部件的清潔，確保儀器良好的運行狀態(tài)。,試劑1 選擇：與儀器匹配，質(zhì)量可靠、性能穩(wěn)定2 保存：按說明保存，冰凍保存的試劑不能反復凍融3 有效期4 不同廠家，不同批號的試劑、新舊試劑不能混用。 5 試劑溶解6 清洗液：4h更換一次,分析中質(zhì)量控制,室內(nèi)質(zhì)量控制1 質(zhì)控品的選擇，質(zhì)控品的定值與穩(wěn)定性要好 2 質(zhì)控的頻度與方法3 靶值確定4 質(zhì)控圖及質(zhì)控規(guī)則5 失控處理,分析中質(zhì)量控制,分析后,報告運