男性不育患者精漿no的含量對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響

1、<p>　　男性不育患者精漿NO的含量對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響</p><p>　　作者：于愛(ài)蓮，柳雅玲，張風(fēng)雪，李亞魯，趙英會(huì) </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 男性不育 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To explore the roles of nitric oxide (NO) content in apoptosis of

2、spermatogenic cells in male infertile cases. METHODS: NO concentration was tested by nitric acid reductase in 80 male infertile cases and 62 normal fertile men. Apoptosis of spermatogenic cells was examined by terminal

3、deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphophatebiotin nick end labeling (TUNEL) in 15 male infertile cases, 12 male infertile cases with level of NO over 135 μmol/L and 15 normal fert</p><p>　

4、　【Keywords】 nitric oxide; male infertile; spermatogenic cells; apoptosis </p><p>　　【摘要】 目的：探討在男性不育中精漿NO含量對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響. 方法：應(yīng)用硝酸還原酶法測(cè)定80例男性不育患者和62例正常有生育能力的健康男性（正常對(duì)照）精漿NO的含量；應(yīng)用TdT介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法檢測(cè)15例男性不育患者、12例精漿NO的含量超

5、過(guò)135 μmol/L的不育患者和15例正常健康男性的生精細(xì)胞凋亡情況；電鏡觀察不育患者生精細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化. 結(jié)果：不育組與正常對(duì)照組精漿 NO含量分別為(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L，差異極顯著（t=8.34，P&lt;0.01）；15例正常生育組精漿NO含量為(76.7±10.4) μmol/L，生精細(xì)胞凋亡率為(3.8±1.3)%；15例不育組

6、NO含量為(112.7±14.3) μmol/L，生精細(xì)胞凋亡率為 (4.7±1.9)%；12例不育組精漿NO含量高(&gt;135 μmol/L)者的生精細(xì)胞凋亡率為（16.3±4.0）%. 不育組精漿NO含量和生精細(xì)胞的凋亡率均高于正常對(duì)照組（P&lt;0.05). 不育組精漿NO含量超過(guò)135 μmol/L者的生精細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組比較兩者差異極顯</p><p

7、>　　【關(guān)鍵詞】 一氧化氮; 男性不育; 生精細(xì)胞;凋亡 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　一氧化氮（NO）具有自由基化學(xué)性質(zhì)和多種生物功能 ［1］. NOS(nitric oxide synthase)廣泛存在于人類生殖系統(tǒng)各組織，參與男性生殖系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，如精子的發(fā)生、成熟及精原細(xì)胞凋亡等. NO通過(guò)調(diào)節(jié)睪丸血供及激素分泌

8、、影響精液質(zhì)量，降低精子細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，影響生殖功能［2-4］. 關(guān)于男性不育患者NO含量與生精細(xì)胞凋亡的關(guān)系目前報(bào)道極少，我們檢測(cè)80例男性不育患者精漿NO的含量，觀察NO的含量與生精細(xì)胞凋亡的關(guān)系,旨在進(jìn)一步探討男性不育發(fā)生的機(jī)制. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b><

9、/p><p>　　199805/200303泰安市各醫(yī)院及章丘市人民醫(yī)院收治的男性不育患者80例,年齡24～41（平均29.3±3.1）歲,婚齡2～12（平均5）a. 育齡夫婦結(jié)婚2 a以上，性生活正常，雙方均未采取任何避孕措施，無(wú)嚴(yán)重軀體性疾病；排除隱睪癥、腮腺炎、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,無(wú)接觸放射線等因素所致的不育；女方無(wú)明顯不育因素. 正常男性生育組62例，身體健康，有正常生育史，無(wú)生殖道疾病，精液常規(guī)正常，

10、年齡23～39（平均28.3±3.0）歲. 檢測(cè)病例禁欲3~5 d，手淫法取精液于潔凈容器中，置37℃恒溫箱中待液化后進(jìn)行檢測(cè). </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1NO含量檢測(cè)用硝酸還原酶特異性將NO3還原為NO2，通過(guò)顯色深淺測(cè)其NO2濃度的高低，間接反映NO的水平. 操作過(guò)程:取待檢精液0.1 mL，然后嚴(yán)

11、格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)專人操作. 用分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠生產(chǎn)）于550 nm，0.5 cm光處,測(cè)定樣品的吸光度A值,根據(jù)下列公式計(jì)算NO含量. NO（μmol/L）＝（測(cè)定管的A值-空白管的A值）/（標(biāo)準(zhǔn)管的A值-空白管的A值）×100 μmol/L×樣品的稀釋倍數(shù). NO測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所. </p><p>　　1.2.2生精細(xì)胞凋亡檢測(cè)取液化的精液2 mL緩慢加

12、入到底部已有2 mL 450 mL/L percoll液的試管中，2000 r/min，離心20 min，取精液與450 mL/L percoll分離液交界處的細(xì)胞層，加入等量的生理鹽水混均，1500 r/min，離心10 min，棄上清，沉淀用生理鹽水配成1∶5濃度的細(xì)胞懸液. 取細(xì)胞懸液一式兩份各10 μL，一份涂在干凈的玻片上（細(xì)胞形態(tài)觀察用），另一份涂在有多聚賴氨酸的玻片上（TUNEL檢測(cè)用），剩余細(xì)胞懸液放入戊二醛固定液中，用

13、于電鏡觀察. 另取一張已制備好的細(xì)胞涂片進(jìn)行HE染色，鏡檢. TdT介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法檢測(cè)凋亡細(xì)胞：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)專人操作. 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所; 鏡下凋亡細(xì)胞的核中有棕褐色顆粒，非凋亡細(xì)胞用蘇木素染為藍(lán)色.細(xì)胞體積縮小，致密染色質(zhì)聚集，斷裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小體. 取戊二醛固定的細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗，餓酸固定，乙醇梯度脫水，用Epon812樹(shù)脂浸透包埋，LKB型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重

14、染色，在透射電鏡（JEM1200，日本）下觀察. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn). </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　不育組與正常對(duì)照組精漿 NO含量分別為(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L，差異極顯著

15、（t=8.34, P&lt;0.01）. 分離的生精細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，在核周聚集，出現(xiàn)境界分明的新月形或塊狀小體. 凋亡的生精細(xì)胞在凋亡的初始階段出現(xiàn)核膜間隙增寬，核電子密度增高，核膜與胞膜分離（Fig 1A）；核膜折疊，互相融合（Fig 1B）；胞膜與核膜裂解，核移外吐（Fig 1C）. </p><p>　　不育伴NO含量升高（&gt;135 μmol/L）患者12例（C組）生精細(xì)胞的凋亡率

16、明顯高于A組(15例正常有生育能力的健康男性)和B組(15例不育患者)（P&lt;0.01);B組與A組間有顯著性差異（P&lt;0.05, Tab 1). 不育患者精漿中NO的含量與生精細(xì)胞的凋亡率呈正相關(guān)(r=0.85, P=0.001). 提示NO的濃度對(duì)精子的形成有一定影響.表1NO含量與生精細(xì)胞凋亡率（略） </p><p><b>　　3討論 </b></p

17、><p>　　eNOS位于所有生精階段的間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞胞質(zhì). 而在附睪和輸精管上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有eNOS分布. 正常生精細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)有eNOS的分布，但在凋亡的精母細(xì)胞中有高濃度的eNOS表達(dá). 本結(jié)果表明，男性不育組精漿NO含量明顯升高者生精細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組比較差異極顯著（P&lt;0.01). 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)不育組精漿NO含量與生精細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)（r=0.85, P=0.001). 提示NO含

18、量異常升高使生精細(xì)胞凋亡增加從而降低生育能力. NO通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡；NO能與睪丸生精細(xì)胞中的含鐵酶相互作用，抑制生精細(xì)胞線粒體呼吸和能量產(chǎn)生；抑制與DNA合成有關(guān)的酶，使DNA合成減少;直接啟動(dòng)p53的表達(dá)［5］. </p><p>　　電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，男性不育患者生精細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮、電子密度升高、核膜折疊、 融合或裂解等一系列變化. 對(duì)男性不育患者生精細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的觀察，可進(jìn)一步了解其

19、不育的發(fā)生機(jī)制，對(duì)臨床診斷和治療提供病理形態(tài)依據(jù)具有重要的意義. </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ Fujisawa M, Yamanaka K, Tanaka H, et al. Expression of endothelial nitric oxide synthase in the sertoli cell of

20、 men with infertility of various causes［J］. BJU Int, 2001;87(1):85-88. </p><p>　?。?］ 楊麥貴，張竹映，鄭善鑾，等. 外源性一氧化氮對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力的影響［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;24（15）：1397-1399. </p><p>　　Yang MG, Zhang ZY, Zheng SL,

21、 et al. An experimental study of nitric oxide effects on human sperm capacitation in vitro［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（15）：1397-1399. </p><p>　?。?］ Aksoy Y, Aksoy H, Akcay F. Does seminal plasma nitr

22、ite reflect nitrite+nitrate concentrations in leukocytospermic infertile men［J］? Am J Reprod Immunol, 2001;45(3):188-189. </p><p>　　［4］ 楊麥貴，張竹映，郝曉柯，等. 無(wú)精子癥患者精子生成基因及一氧化氮水平的探討［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;24（13）：1205-120

23、7. </p><p>　　Yang MG, Zhang ZY, Hao XK, et al. Spermatoleosis gene and NO level in patients with azoospermia and oligozoospermia ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（13）：1205-1207. </p><p>　?。?/p>