Cdc25B mRNA在雞十二指腸粘膜的表達——核酸原位雜交法.pdf

1、雞是發(fā)育生物學中重要的研究模式生物之一，對其保守基因結(jié)構(gòu)和功能的研究不但可以闡述其在發(fā)育生物學中的作用，而且得到的結(jié)果還可運用到人和哺乳動物疾病的預防和控制上。CDC25磷酸激酶家族是一類在生物進化過程中高度保守的細胞周期調(diào)控因子，調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育；同時在成體中CDC25的異常活化會導致人類一系列高發(fā)性腫瘤的發(fā)生。近年來對CDC25B磷酸激酶的研究成為發(fā)育生物學和腫瘤醫(yī)學的一個熱點，許多研究認為它與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后有關，檢測

2、Cdc25B的表達有望成為判斷腫瘤細胞有絲分裂指數(shù)和增殖能力一個可靠的分子指標。本試驗應用自行合成的地高辛標記的RNA探針在雞成體組織上進行原位雜交的方法，檢測Cdc25B基因轉(zhuǎn)錄體在雞十二指腸粘膜的表達情況，以期探明禽類腸道上皮增殖規(guī)律和功能分區(qū)，并能與哺乳動物中Cdc25B在成體組織上的表達情況進行比較，為研究禽類消化特征和發(fā)育的分子機制提供實驗依據(jù)，并為研究CDC25B的致瘤機理以及合成其抑制劑提供一定的理論依據(jù)。
　　

3、試驗ⅠCdc25B mRNA探針的合成
　　 應用Primer5.0引物設計軟件，以Gene Bank中登陸序列號為AJ720997的雞Cdc25B mRNA序列為參照設計引物。提取孵育36h雞胚胎的總RNA，通過RT-PCR及PCR從雞的總RNA中擴增Cdc25B目的基因片段，將目的DNA純化回收后，用TA克隆的方法將目的片段克隆到pGM-easy T載體中然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆，測序鑒定目的片段。分別利用pGM-T

4、easy質(zhì)粒中T7和SP6啟動子及T7和SP6RNA聚合酶，以線性化的Cdc25B/pGM-T easy為模板轉(zhuǎn)錄合成正、反義DIG標記的RNA探針。迅速將合成好的DNA探針進行純化，然后用分光光度計測定探針的標記效率和濃度，正反義探針濃度均接近200ng/μl，電泳結(jié)果表明探針成功合成，可進一步應用于ISHH試驗。
　　 試驗Ⅱ雞十二指腸粘膜上皮Cdc25B的原位雜交反應
　　 通過原位雜交（in situ hybri

5、dization histochemistry， ISHH）技術(shù)，用實驗Ⅰ合成的探針探查Cdc25B mRNA在雞十二指腸粘膜上皮中的分布情況。結(jié)果表明，成年雞十二指腸腸腺上皮細胞中有豐富的Cdc25B mRNA的轉(zhuǎn)錄，其中Cdc25B mRNA探針雜交陽性細胞在腸腺基底部和小腸絨毛中部分別占上皮細胞總數(shù)的81.60％±9.63％和36.21％±8.81％。原位雜交陽性產(chǎn)物大部分分布于十二指腸腸腺上皮“干細胞部”和“增生部”細胞的胞質(zhì)和

6、胞核中，腸腺基底部由下至上，雜交信號逐漸減弱，至小腸絨毛下部消失，轉(zhuǎn)為陰性。在粘膜肌層以及肌肉層里雜交反應呈陰性。本研究從基因水平證明了雞十二指腸粘膜腸腺上皮“干細胞部”和“增生部”細胞中有Cdc25B mRNA的存在，表明該區(qū)域有活躍的增殖過程，以補充絨毛上端死亡脫落的細胞。Cdc25B的表達趨勢與哺乳動物上皮細胞增殖分區(qū)相一致，推測雞的腸腺和粘膜上皮也和哺乳動物一樣分為腸腺基部的“潘氏細胞-干細胞部”和中部的“增生部”、腸腺上部“成