大團(tuán)囊蟲草菌發(fā)酵菌絲類雌激素活性研究.pdf

1、大團(tuán)囊蟲草(Cordyceps ophioglossoides)是民間用于治療血崩、月經(jīng)不調(diào)等癥的一類蟲草菌。野生資源的匱乏使得它的研究長期受到阻滯。本論文通過液體發(fā)酵工藝解決資源匱乏的難題，對其發(fā)酵菌絲進(jìn)行了全面的活性組分和動物藥效實驗，揭示了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并對其類雌激素活性作用機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　 首先，采用形態(tài)學(xué)與分子生物許特征對采集到的菌株進(jìn)行，確證屬于大團(tuán)囊蟲草種。菌種保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏

2、管理委員會普通微生物中心，保存編號為：CGMCCNo.1146。本實驗室已獲得國家發(fā)明專利(ZL200410025774.6)，從源頭上保護(hù)這一稀貴藥用資源。
　　 通過其野生生長環(huán)境的分析和其他蟲草類真菌生長條件的資料借鑒，利用多種統(tǒng)計學(xué)手段，建立大團(tuán)囊蟲草菌發(fā)酵工藝。較優(yōu)小試發(fā)酵工藝為：培養(yǎng)基蔗糖669．L-1、酵母粉109．L-1、蛋白水解液30 ml-L-1、MgS04.7H200.4 goL-1、KH2P040.4go

3、L-1;搖瓶培養(yǎng)條件為23℃，初始pH5.5，通氣量1:0.6，轉(zhuǎn)速120rpm;針對其中多糖、多酚類以及蟲草酸的產(chǎn)量進(jìn)行了進(jìn)一步的發(fā)酵工藝優(yōu)化，最終得到了有利于此三者產(chǎn)量的優(yōu)化工藝：培養(yǎng)基為葡萄糖75g．L-1，酵母粉5g.L-1，蠶蛹水解液30ml/L，無機(jī)鹽離子為磷酸二氫鈉0.4g.L1和磷酸氫二鉀0.4g．L-1，起始pH為4.0，溫度為23℃；并在小試結(jié)果基礎(chǔ)上成功完成從100L到20噸發(fā)酵放大的研究。優(yōu)化條件也確證了從野生到

4、人工培養(yǎng)的過程中，對天然生長環(huán)境的分析至關(guān)重要。并為下一步的活性成分分析和作用機(jī)理研究提供了基礎(chǔ)。
　　 初步藥理藥效實驗表明菌絲具有較弱的雌激素活性。急性毒副反應(yīng)未明顯顯示。采取中壓液相、高效液相色譜等分離手段對發(fā)酵菌絲主要活性組分進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明其內(nèi)主要活性組分含量分別為蟲草多糖21.8 mg/g、蟲草酸65.89mg/g、總蛋白24.7mg/g、腺苷0.65 mg/g、多酚類21.8 mg/g和黃酮類含量13.2 m

5、g/g干菌粉。研究表明發(fā)酵菌絲具有與許多蟲草類天然和發(fā)酵菌絲相類似的活性成分，特別是多酚類黃酮類含量豐富，人工培養(yǎng)的大團(tuán)囊蟲草菌絲不但安全且具有豐富活性成分。
　　 本論文利用細(xì)胞增殖率實驗研究了大團(tuán)囊蟲草提取物對雌激素受體陽性和陰性兩株乳腺癌細(xì)胞的生長影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物能夠促進(jìn)雌激素受體陽性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，對雌激素受體陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長幾乎沒有影響，暗示了我們提取物通過雌激素受體起作用。利用熒光

6、素酶報告基因ERE-TK-Luc質(zhì)粒的構(gòu)建，進(jìn)一步揭示了提取物在進(jìn)入到細(xì)胞之后能夠使得ERE基因轉(zhuǎn)錄起始，其作用與雌二醇類似但弱于雌二醇，并且和雌二醇有一定的競爭關(guān)系。通過實時定量PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀的方法進(jìn)行作用途徑的探索，研究表明發(fā)酵菌絲提取物與ER結(jié)合之后能夠激活Myc2，CyclinD，pS2的轉(zhuǎn)錄，在宏觀上表現(xiàn)為類雌激素的活性。對浸提物的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，對DPPH自由基的清除率達(dá)到70％以上，對羥基自由基和超氧自由基的

7、清除率也均能達(dá)到與公認(rèn)的抗氧化藥品效果相當(dāng)。大團(tuán)囊蟲草發(fā)酵菌絲的類雌激素活性作用途徑研究盡管顯示出類似于E2的活性，但其復(fù)合型的作用也暗示了其可能存在多通道多靶點的作用方式，接近于植物雌激素的選擇性作用，安全有效的特點使其很可能成為一種具有雌激素替代治療效用的潛在藥物。
　　 綜上所述，本論文建立了稀有名貴藥用真菌大團(tuán)囊蟲草發(fā)酵工藝，解決野生資源匱乏的問題；解析其發(fā)酵菌絲活性組分并探索藥理學(xué)效果其作用機(jī)理。研究成果為分析藥用真菌