核黃素激活煙草防衛(wèi)反應(yīng)和誘導(dǎo)對(duì)兩種土傳病害的抗性研究.pdf

1、核黃素(維生素B2)是一種水溶性B族維生素。核黃素的基本生物功能是以單核苷酸(FMN)或黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式作為輔酶，參與動(dòng)植物和微生物的以氧化.還原反應(yīng)為特征的多個(gè)生理生化過(guò)程。 一些研究表明對(duì)多種植物體外使用核黃素，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量和誘導(dǎo)植物對(duì)一些病害的抗性，啟動(dòng)抗病信號(hào)通路。目前對(duì)于核黃素激活的防衛(wèi)反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制還缺乏系統(tǒng)研究。本研究以核黃素作為激發(fā)子，以煙草懸浮細(xì)胞和煙草幼苗為研究體系，通過(guò)生

2、物化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、半定量RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)和高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)等方法測(cè)定了一系列防衛(wèi)反應(yīng)和對(duì)煙草兩種重要土傳病害的誘導(dǎo)作用。所得結(jié)果如下： 1.用1 mmol·L-1核黃素處理煙草懸浮細(xì)胞，測(cè)定了氧化迸發(fā)和培養(yǎng)介質(zhì)堿性化的變化。結(jié)果表明1

3、mmol·L-1核黃素處理懸浮細(xì)胞后；產(chǎn)生了氧化迸發(fā)和培養(yǎng)介質(zhì)堿性化。氧化迸發(fā)在誘導(dǎo)后5 min產(chǎn)生，1 h時(shí)達(dá)到最大值；而胞外培養(yǎng)基隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)其pH值逐漸升高，當(dāng)誘導(dǎo)80 min時(shí)pH值提高了0.57。說(shuō)明核黃素可以激活煙草懸浮細(xì)胞這些常見(jiàn)早期反應(yīng)。 為了說(shuō)明鈣信號(hào)和蛋白磷酸化對(duì)這些早期反應(yīng)的影響，用鈣離子通道抑制劑LaCl3、鈣離子螯合劑EGTA和一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑staurosporine處理細(xì)胞，測(cè)定了

4、防衛(wèi)反應(yīng)被抑制的情況。結(jié)果顯示這些早期反應(yīng)可以被LaCl3、EGTA和staurosporine不同程度地抑制，說(shuō)明在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中鈣信號(hào)和蛋白磷酸化參與了這一過(guò)程。 2.為了闡明核黃素是否誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞防衛(wèi)基因的表達(dá)，我們通過(guò)半定量RT-PCR方法測(cè)定了4種防衛(wèi)基因PR(pathogenesis-related)-1α、PR-1b、PAL(phenylalanine ammonia lyase)和LPO(lignin perox

5、idase)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示2個(gè)PR基因在誘導(dǎo)后的6h表達(dá)量即達(dá)到最大水平，PAL和LPO基因的表達(dá)啟動(dòng)較慢，在誘導(dǎo)后的6h表達(dá)水平才有明顯變化，至24 h表達(dá)量達(dá)到最高水平。 為了闡明核黃素對(duì)煙草細(xì)胞苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase，PAL)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性以及抗病相關(guān)的酚類物質(zhì)、木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物含量的影響，分別測(cè)定一系列與防衛(wèi)相關(guān)的生理和生化指標(biāo)。結(jié)

6、果表明核黃素處理后PAL和POD活性明顯升高，處理12 h和24 h后酶活性分別達(dá)到峰值；熒光觀察細(xì)胞壁積累了更多的酚類物質(zhì)，核黃素處理后的24 h和48 h，煙草懸浮細(xì)胞總酚含量分別比對(duì)照提高了1.2和1.5倍；胞內(nèi)和胞外scopoletin(7-羥基-6-甲氧基香豆素)含量明顯升高，在處理12 h后都達(dá)到峰值，分別是對(duì)照的3.6和3.9倍；木質(zhì)素染色和含量測(cè)定表明核黃素處理后煙草懸浮細(xì)胞沉積了更多的木質(zhì)素，處理24 h和48 h后，

7、木質(zhì)素含量分別為對(duì)照的13和1.8倍。說(shuō)明核黃素提高了煙草懸浮細(xì)胞PAL、POD活性，積累了更多的與抗病有關(guān)的次生代謝產(chǎn)物。 3.用核黃素噴霧處理煙草幼苗，測(cè)定了不同煙草品種(系)根部接種煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)和青枯病菌(Ralstonia solanacearu)發(fā)病后的病情指數(shù)，以及青枯細(xì)菌在煙草組織內(nèi)的群體數(shù)量變化。結(jié)果表明，7個(gè)煙苗品種(系)經(jīng)核黃素