第18章遺傳疾病的診斷

1、<p>　　第十八章　遺傳病的診斷</p><p>　　遺傳病診斷是一項復雜的工作，需要多學科的密切配合。遺傳病的診斷包括常規(guī)診斷和特殊診斷。常規(guī)診斷指與一般疾病相同的診斷方法，特殊診斷是指采用遺傳學方法，包括染色體檢查，家系分析等，是遺傳病確診的關鍵。目前，臨床上遺傳病診斷包括：臨癥診斷、癥狀前診斷（presymptomatic diagnosis）、出生前診斷和植入前診斷。</p>&

2、lt;p><b>　　第一節(jié) 臨癥診斷</b></p><p>　　臨癥診斷（symptomatic diagnosis）是根據(jù)患者的各種臨床表現(xiàn)進行分析，確診并判斷遺傳方式，是遺傳病診斷的主要內(nèi)容。</p><p>　　一、病史、癥狀和體征</p><p><b>　　（一）病史</b></p>&l

3、t;p>　　遺傳病大多有家族聚集傾向，因此病史的采集非常重要。在采集病史時要準確、詳盡。另外還要收集病人的家族史、婚姻史和生育史等相關信息。遺傳病史的采集比其他疾病更重要，因為遺傳病的家族聚集性和其傳遞的規(guī)律性決定了病史采集可能會獲得更有用的信息，對后續(xù)的分析工作可能會有很大的幫助。病史采集的關鍵是材料的真實性和完整性。病史采集，主要是通過采集對象的描述和有關個體的病案查詢工作來完成。實踐中還應注意不同個體描述是否可以相互印證，以

4、確定資料的可信度。對于發(fā)病原因、過程、時間、地點、治療情況等也應詳細記錄。</p><p><b>　?。ǘ┌Y狀與體癥</b></p><p>　　遺傳病除了具有其他疾病相同的體征外，還有特異性征候群，這些都為初步診斷提供線索。大多遺傳病在嬰兒和兒童期有相應的體征和癥狀，如Down綜合征患兒的特殊面容和智力低下等，當然還需要通過染色體檢查進一步確診。</p&g

5、t;<p><b>　　二、家系分析</b></p><p>　　根據(jù)對患者及家族成員發(fā)病情況的調(diào)查結(jié)果繪制系譜，確定單基因病或多基因病，遺傳方式等。系譜分析時應注意：系譜的完整性和準確性；單基因遺傳病的分析非常有用，常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病，X連鎖顯性遺傳病，X連鎖隱性遺傳病，Y連鎖遺傳病。單基因遺傳分析中要注意外顯不全，延遲顯性，顯、隱性的相對性，新的突變產(chǎn)生

6、，遺傳印記，動態(tài)突變，以及遺傳異質(zhì)性等問題，避免判斷上的錯誤和發(fā)病風險的錯誤估計。</p><p>　　線粒體遺傳病通過母系遺傳，主要特點是晚發(fā)，進行性。多基因病是一大類常見的疾病，有家族聚集傾向，但不遵循孟德爾分離規(guī)律。</p><p>　　以往被認為是多基因病的一些疾病，一部分被證明是遺傳異質(zhì)性所致，即受單個主基因決定，如癲癇，先天性心臟病和先天性巨結(jié)腸等。</p>&l

7、t;p><b>　　三、細胞遺傳學檢查</b></p><p>　　細胞遺傳學檢查染色體檢查或核型分析，是輔助診斷和對染色體病確診的主要方法。隨著顯帶技術的應用，特別是高分辨染色體顯帶技術的發(fā)展，能夠更準確地發(fā)現(xiàn)和確定更多的染色體數(shù)目和結(jié)構異常，并發(fā)現(xiàn)新的微小畸變綜合征。利用染色體顯帶技術，可以對許多疾病在染色體水平找到原發(fā)性改變，如腫瘤，發(fā)育缺陷、心血管疾病等，把疾病相關基因確定在一

8、個較小的范圍內(nèi)。</p><p>　　染色體原位雜交是應用標記的DNA片段（探針）與玻片標本上的細胞、染色體，以及間期的DNA或RNA雜交，研究核酸片段的位置、相互關系的技術。一般用生物素、地高辛等標記探針，原位雜交后，用熒光染料標記的生物素親和蛋白、抗親和蛋白的抗體進行免疫檢測和雜交信號放大，使探針雜交的區(qū)域發(fā)出熒光，這種原位雜交稱熒光原位雜交（FISH），靈敏度高，特異性強，可以檢測染色體微小結(jié)構異常，也可應

9、用在基因定位和基因制圖等領域。另外還有雙色FISH、多色FISH和染色體涂染等方法，大大提高了染色體畸變的檢出率和準確性。</p><p>　　染色體檢查標本主要有外周血，羊水中胎兒脫落細胞和胎兒的臍帶血，病人的骨髓、胸腹水、手術切除的病理組織，培養(yǎng)細胞等。</p><p>　　染色體檢查適應癥包括：明顯智力發(fā)育不全者；生長遲緩或伴有其他先天畸形者；夫妻之一有染色體異常，如平衡異位，嵌合體

10、等；家族中已有染色體異?；蛳忍旎蔚膫€體；多發(fā)性流產(chǎn)婦女及其丈夫；原發(fā)性閉經(jīng)和女性不育癥；無精子癥和不育的男性；兩性畸形者；疑為先天愚型的患兒及其父母；原因不明的智力低下并伴有大耳、大睪丸和多動癥者；35歲以上的高齡孕婦。</p><p><b>　　四、生化檢查</b></p><p>　　生化檢查是遺傳病診斷的重要輔助手段，主要是對由于基因突變所引起的酶和蛋白質(zhì)的

11、定量和定性分析，對單基因病和先天性代謝病進行診斷，包括一般的臨床生化檢驗和針對遺傳病的特異檢查。</p><p>　　目前已知的多種遺傳性代謝病中，大多數(shù)為酶缺陷?？捎捎诨蛲蛔?、基因缺失、基因表達異?；蚍g后加工修飾缺陷所致。目前臨床主要對酶活性和代謝產(chǎn)物進行檢測，以血液和尿液為主要檢材，有的可以制成濾紙片和通過顯色反應進行檢測，隨著對遺傳病發(fā)病機理認識的深入和檢測方法的改進，檢測將更加簡便、快捷。</p

12、><p>　　第二節(jié) 出生前診斷</p><p>　　出生前診斷或稱產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis）是采用羊膜穿刺術或絨毛取樣等技術，對羊水、羊水細胞和絨毛進行遺傳學檢驗，對胎兒的染色體、基因進行分析診斷，是預防遺傳病患兒出生的有效手段，越來越廣泛的被應用。</p><p><b>　　一、出生前診斷對象</b></p>

13、;<p>　　根據(jù)遺傳病的危害程度和發(fā)病率，可將出生前診斷的對象排列如下：①夫婦之一有染色體畸變，特別是平衡易位攜帶者，或者夫婦染色體正常，但生育過染色體病患兒的孕婦；②35歲以上的孕婦；③夫婦之一有開放性神經(jīng)管畸形，或生育過這種畸形患兒的孕婦；④夫婦之一有先天性代謝缺陷，或生育過這種患兒的孕婦；⑤X連鎖遺傳病致病基因攜帶者孕婦；⑥有習慣性流產(chǎn)史的孕婦；⑦羊水過多的孕婦；⑧夫婦之一有致畸因素接觸史的孕婦；⑨有遺傳病家族史，

14、又系近親結(jié)婚的孕婦。但應當注意，已出現(xiàn)先兆流產(chǎn)、妊娠時間過長、有出血傾向者的孕婦不宜做產(chǎn)前診斷。</p><p>　　二、出生前診斷的方法</p><p><b>　?。ㄒ唬〣超 </b></p><p>　　B超是一種安全無創(chuàng)的檢測方法，能夠詳細檢查胎兒的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構，使許多遺傳性疾病得到早期診斷?？梢栽\斷的疾病有，神經(jīng)管缺陷、腦積水

15、、無腦畸形；唇裂、腭裂，頸部淋巴管腫瘤；先天性心臟病，支氣管、肺發(fā)育異常、胸腔積液；其他的異常，如先天性單側(cè)腎缺如，先天性幽門狹窄、先天性巨結(jié)腸等。</p><p><b>　　（二）羊膜穿刺</b></p><p>　　羊膜穿刺是在B超的監(jiān)視下，用消毒的注射器抽取胎兒羊水（圖18-1）?？梢詫Τ槿〉难蛩捌渲械奶好撀浼毎M行細胞培養(yǎng)，分析染色體，以及生化和基因的檢

16、測。如羊水中甲胎蛋白濃度過高時，提示胎兒可能有無腦、開放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和腦積水等異常。羊膜穿刺一般在妊娠16～20周進行，流產(chǎn)的風險相對較小。</p><p>　　圖18-1 羊膜穿刺示意圖</p><p><b>　?。ㄈ┙q毛取樣法</b></p><p>　　絨毛取樣一般在妊娠7～9周進行，是妊娠早期診斷方法。也是在B超監(jiān)視下，

17、用特制的取樣器，從陰道經(jīng)宮頸進入子宮，沿子宮壁到達取樣部位，用內(nèi)管吸取絨毛（圖18-2）。絨毛取樣的優(yōu)點是檢查時間早，需要作出選擇性流產(chǎn)時，給孕婦帶來的損傷和痛苦較小。缺點是經(jīng)子宮頸取樣標本容易被污染，胎兒和母體感染和操作不便，引起流產(chǎn)的風險是羊膜穿刺的兩倍。</p><p>　　羊膜穿刺法和絨毛取樣可用來診斷染色體病，遺傳代謝病，胎兒性別鑒定，所有可用胚胎或胎兒DNA檢測的疾病，另外，開放性神經(jīng)管缺陷只能采用羊

18、膜穿刺術診斷。</p><p>　　圖18-2 絨毛取樣法示意圖</p><p><b>　　（四）臍帶穿刺術</b></p><p>　　臍帶穿刺術是在B超的監(jiān)視下，用細針經(jīng)腹壁、子宮進入胎兒臍帶抽取胎兒血液。本方法取樣最好在妊娠18周，常用于因錯過絨毛取樣或羊膜穿刺最佳時機或羊水檢查失敗的補救措施，還可以檢測胎兒的血液系統(tǒng)疾病，先天性免疫缺

19、陷，某些單基因病。</p><p><b>　?。ㄎ澹┨虹R檢查</b></p><p>　　又稱羊膜腔鏡或?qū)m腔鏡檢查，它可在進入羊膜腔后，直接觀察胎兒的外形、性別和發(fā)育狀況，是否有畸形，還可以同時抽取羊水或胎血進行檢查，或進行宮內(nèi)治療。因此，理論上這是一種最理想的方法。但由于操作困難，容易引起多種并發(fā)癥，目前還不能被廣泛采用。胎兒鏡檢查的最佳時間是妊娠18～20周，

20、可以診斷大皰性表皮松懈癥及某些皮膚病。</p><p>　　（六）分離孕婦外周血中的胎兒細胞</p><p>　　目前用于出生前診斷材料的獲得對于胎兒和母體都是創(chuàng)傷性的，存在流產(chǎn)和感染等風險。從20世紀90年代末，開始探索一種無創(chuàng)傷性的出生前診斷方法。利用妊娠期少量胎兒細胞可以通過胎盤進入母體血液中，采用流式細胞儀分離技術，磁激活細胞分選技術，免疫磁珠法，顯微操作分選法，分離胎兒細胞。用這

21、些方法富集的胎兒細胞很少，需要用高靈敏的技術方法進行下一步分析檢測，目前常用的方法是PCR。</p><p><b>　?。ㄆ撸┲踩肭霸\斷</b></p><p>　　隨著人工受精，試管嬰兒和胚胎移植技術的開展，以及單個細胞基因診斷技術的應用，目前正探索在胚胎植入前診斷（pre-implantation diagnosisi）。在受精后6天胚胎著床前，通過顯微操作技術

22、取出一個細胞，應用PCR，F(xiàn)ISH等技術進行特定基因和染色體畸變的檢測，將人類的遺傳缺陷掌控在最早階段，這是遺傳病產(chǎn)前診斷的重大突破。</p><p><b>　　第三節(jié) 基因診斷</b></p><p>　　利用分子生物學的技術，檢測體內(nèi)DNA或RNA結(jié)構或表達水平變化，從而對疾病做出診斷的方法，稱為基因診斷（gene diagnosis），通常又稱為分子診斷（mo

23、lecular diagnosis）。基因診斷始于1978年，應用限制性酶切長度多態(tài)性（RFLP）技術檢測胎兒鐮狀細胞貧血癥。 </p><p>　　基因診斷技術已逐步從實驗研究進入臨床應用，不僅適用于遺傳性疾病，而且已擴展到一些感染性疾病、腫瘤的診斷。</p><p>　　基因診斷具有如下特點：以特定基因為目標，檢測基因的變化，特異性性強；采用分子雜交技術和PCR技術具有信號放大作用，用

24、微量樣品即可進行診斷，靈敏度高；在疾病尚無出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前，胎兒出生前的產(chǎn)前診斷，以及特定人群的篩查等，應用廣泛；檢測樣品獲得便利，不受個體發(fā)育階段性和基因表達組織特異性的限制。 </p><p>　　需要說明的是，由于基因突變的類型多種多樣，除了缺失、倒位、點突變、動態(tài)突變可以進行基因的檢測外，大多數(shù)基因突變的分析復雜而繁瑣，有一定的難度。</p><p>　　一、基因診斷的主要技術方法&

25、lt;/p><p>　　基因診斷主要采用核酸分子雜交、PCR和DNA序列測定等技術。</p><p><b>　　（一）核酸分子雜交</b></p><p>　　核酸雜交技術是在基因診斷中，用于檢測樣品中是否存在相應的基因以及相應基因表達狀態(tài)等等。其中Southern印跡法主要用于基因組DNA的分析，Northern印跡法用于檢測樣品中RNA的種類

26、和含量。</p><p>　　1. 斑點印跡雜交 把待檢測的核酸樣品點在NC膜上，變性后與標記的探針進行結(jié)合反應，經(jīng)過顯色和顯影后檢測雜交信號的強度，與對照樣品比較后確定所測核酸量的高低。根據(jù)NC膜上所點核酸樣品的種類不同，分為DNA dot blotting和 RNA dot blotting。點樣方式如采用狹縫點樣器點樣，得到的線狀雜交信號，稱狹線印跡法。</p><p>　　2.

27、 原位雜交 把組織或細胞樣品經(jīng)過適當處理，用探針與核酸進行雜交。這種方法不需要提取核酸，可以確定被檢核酸在組織或細胞，以及中期染色體中的定位，具有重要的生物學和病理學意義。</p><p>　　3. PCR-ASO ASO為等位基因特異性寡核苷酸雜交法（allele-specific oligonucleotide，ASO）的簡稱，是基于核酸雜交的一種方法。根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設計和制備與野生型或

28、突變型基因序列互補的兩種探針，分別與被檢測者樣品中的DNA分子進行雜交，根據(jù)樣品與兩種探針雜交信號的強弱，確定是否存在基因突變，判斷被檢者是突變基因的純合體或雜合體（圖18-3）。</p><p>　　圖18-3　ASO探針雜交原理示意圖</p><p>　　4．基因芯片技術　基因芯片技術是近年來發(fā)展十分迅速的大規(guī)模、高通量分子檢測技術。基本過程是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針

29、，有規(guī)律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或尼龍膜等，形成矩陣點?，F(xiàn)在的技術可以做到在1cm2上排列成千上萬個“點”。樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術摻入熒光標記分子，然后與待測樣本進行雜交反應，再通過激光共聚焦熒光顯微鏡對芯片進行掃描，獲取信息，電腦系統(tǒng)分析處理所得資料，對上千種甚至更多基因的表達水平、突變和多態(tài)性進行快速、準確的檢測。</p><p>　　基因芯片可以進行微量化、大規(guī)模、并行化

30、、高度自動化地處理有價值的生物樣品，精細地研究各種狀態(tài)下分子結(jié)構變異，了解組織細胞基因表達情況。既可檢測基因的多態(tài)性，又能檢測基因突變，特別適用于多個基因、多個位點的同時檢測。這一技術目前處于發(fā)展和優(yōu)化階段，已經(jīng)有多種針對遺傳性疾病、腫瘤檢測的基因芯片用于臨床診斷。</p><p>　　（二）其它常用的技術　</p><p>　　1. PCR-RFLP 將聚合酶鏈反應（PCR）與RFL

31、P方法結(jié)合的一種檢測技術。由于DNA序列的差異，造成了內(nèi)切酶位點的變化，或是新酶切位點的產(chǎn)生；或是原酶切位點的消失等。通過酶切后電泳圖譜的判斷，確定檢測結(jié)果。該方法包括①PCR：利用一對或數(shù)對特異性引物，將目標DNA擴增；②酶切：利用某些限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，如PCR產(chǎn)物中含有相應的酶切位點序列，DNA鏈則被切開；③利用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠分離酶切后的PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳圖譜判斷結(jié)果。</p><p>

32、;　　如果某DNA序列已經(jīng)全部確定，則可以通過計算機輔助設計特異性PCR引物；擴增DNA片段和進行酶切位點分析，該方法簡便易行，精確度也很高。但是該方法也有一定的局限性，如果多態(tài)性位點的DNA序列沒有相應的內(nèi)切酶，則該方法不適用。</p><p>　　2. PCR-SSCP 單鏈構象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP），是一種檢測核酸序列中點突變的技

33、術。當雙鏈DNA變性為兩條單鏈后，會在中性條件下形成各自特定的空間構象，因而在電泳時將在不同的位置上出現(xiàn)不同的電泳條帶。如果DNA序列發(fā)生改變，甚至僅有一個堿基變化時，空間構象有可能發(fā)生改變，電泳時表現(xiàn)出不同的遷移率，被檢DNA電泳條帶與已知序列的對照DNA電泳條帶不一致，出現(xiàn)新生條帶時，表明有突變存在（圖18-4）。該方法與PCR聯(lián)合應用，因此稱PCR-SSCP，主要用于突變分子的初步篩查。</p><p>　

34、　圖18-4 SSCP原理示意圖</p><p>　　3. RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR以mRNA為模板合成cDNA，再進行PCR，用于基因表達水平的檢測和分析。</p><p>　　4. Western 印跡技術 Western 印跡技術是檢測特定蛋白質(zhì)的方法，可用于某種與遺傳病相關的蛋白質(zhì)定性定量分析。如假肥大型肌營養(yǎng)不良（DMD）患者基因缺陷使肌細胞的增強蛋白（dystrop

35、hin）合成異常，采用Western 印跡法檢測患者增強蛋白，進行診斷。</p><p>　　二、基因診斷技術的應用</p><p>　?。ㄒ唬┗蛟\斷在遺傳病中的應用</p><p>　　1．鐮狀細胞貧血的基因診斷　鐮狀細胞貧血癥的基因突變發(fā)生在珠蛋白基因內(nèi)部，可以用限制性內(nèi)切酶MstⅡ進行檢測?；诰幋a珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變?yōu)镚TG，改變了限制性內(nèi)切酶

36、MstⅡ的酶切位點。當酶切正常人DNA和患者DNA后再用標記的珠蛋白基因為探針作Southern雜交時，就會出現(xiàn)不同的DNA條帶。限制性內(nèi)切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一種核苷酸），切割正常DNA產(chǎn)生1.15kb DNA片段；若切割患者DNA時，形成1.35kb 珠蛋白的DNA片段，雜合體則形成1.15，1.35兩個片段（圖11-7）。</p><p>　　2．血友病A的基因診斷　血友病A是

37、X連鎖隱性遺傳病，由于遺傳性凝血障礙所致的出血性疾病。該病是凝血因子Ⅷ（FactorⅧ，F(xiàn)Ⅷ）基因的缺陷，其中大范圍的基因重排（如缺失、插入和重復）只占5％，主要突變類型為堿基取代或少數(shù)堿基的缺失和插入，這些突變產(chǎn)物可能是不完整的、無活性的或不穩(wěn)定的因子Ⅷ肽鏈，導致臨床癥狀輕重不一。采用基因診斷方法可以檢出有部分基因缺失的患者和女性攜帶者，可進行產(chǎn)前檢查。對該基因的產(chǎn)前診斷可以通過RFLP連鎖分析進行，在基因的內(nèi)側(cè)及旁側(cè)有多組RFLP位

38、點可供基因診斷。目前多采用PCR技術與RFLP相結(jié)合的方法，先用PCR技術將包含突變DNA的片段擴增出來，然后用識別該位點的限制酶來酶切，電泳后直接檢測多態(tài)性位點的狀態(tài)。</p><p>　　3. 地中海貧血的基因診斷 地中海貧血是由于基因的缺失造成的。鏈是由兩對基因控制的，如果在一條16號染色體上的2個基因都缺失，稱為0地貧；如果一條16號染色體上的2個基因缺失一個，稱為+地貧，這兩種地貧基因可以組合引起不同

39、的綜合征。在基因的兩端設計引物，擴增后的片段電泳，可以檢測缺失突變，確定被檢測者的基因型，對可疑的胎兒進行產(chǎn)前診斷。</p><p>　?。ǘ┗蛟\斷在腫瘤中的應用</p><p>　　腫瘤發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟過程，涉及多個癌基因的結(jié)構改變和表達異常，如抑癌基因的缺失和突變等?；蛟\斷除了用于腫瘤的早期診斷外，還可以對腫瘤進行腫瘤的臨床分類、預后，對腫瘤高危人群的篩選，指導個體

40、化治療和預防。</p><p>　　1. 肺癌 近年來對肺癌的細胞遺傳學研究表明，肺癌發(fā)生時常涉及1，2，3，5，6，9，11，13，17號染色體的缺失，易位，ras 、myc、 erb和 src癌基因的擴增、突變，以及抑癌基因Rb 、p53的突變或缺失，應用PCR-ASO，PCR-SSCP，測序，以及FISH，可以檢測其基因突變或缺失。肺癌患者常存在ras 、myc、 erb和 src癌基因的過表達，因此可采

41、用Northern印跡方法進行RNA檢測與分析，在基因水平診斷肺癌。</p><p>　　2. 乳腺癌 乳腺癌是女性最常見腫瘤之一，癌基因nue與乳腺癌的發(fā)生和預后密切相關，表達產(chǎn)物為表皮生長因子（EGF）樣受體，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶（TPK）家族成員。有Nue基因擴增的患者復發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，可作為乳腺癌預后的一項重要指標。采用Southern印跡法，可以檢測Nue基因的拷貝數(shù)；Northern印跡方法檢測N

42、ue基因表達水平，進行定量分析。 </p><p>　　3. 大腸癌 在腸癌癌變的過程中存在抑癌基因FAP（family adenomatous polyposis）、DCC、p53基因的丟失，p53基因的突變；癌基因K-ras的點突變、C-myc的過量表達等現(xiàn)象。</p><p>　　ras基因突變的檢測可采用PCR-ASO方法進行，已知ras基因突變的熱點在12、13及61密碼子，可

43、人工合成位于待測點兩側(cè)的引物，分別擴增含12、13及61位點的基因片段，將擴增產(chǎn)物結(jié)合在NC膜上分別與相應的堿基突變特異性寡核苷酸探針雜交，檢測突變類型。還可以采用PCR-SSCP方法，對ras基因突變進行初篩，再通過DNA測序檢測點突變，簡便、準確。</p><p>　　p53基因的缺失、突變、失活是許多腫瘤發(fā)生的原因，這些腫瘤包括成骨肉瘤、肺癌、結(jié)（直）腸癌、神經(jīng)纖維肉瘤。腦瘤、乳腺癌等。該基因的突變可引起蛋