海藻酸鈉碳納米材料固定化對苯二甲酸降解菌的工藝研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　海藻酸鈉碳納米材料固定化對苯二甲酸降解菌的工藝研究</p><p><b>　　摘 要<

2、/b></p><p>　　為了提高PTA廢水的處理效率，采用固定化微生物的方法來處理PTA廢水。通過實驗得出采用2%海藻酸鈉混合0.45%的碳納米材料包埋PTA降解菌使得PTA降解率達到最大。固定化PTA降解菌的最適溫度是30℃，最適pH為7。同時通過固定床處理得出PTA溶液通過固定化細胞的流速為30mL/min，高徑比為30:1（即柱高為30cm，內(nèi)徑為1cm），PTA濃度為0.2-0.4g/L時，PT

3、A的降解率達到最大。</p><p>　　關(guān)鍵詞：PTA降解菌；固定化；碳納米材料</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In order to improve the PTA wastewater treatment efficiency, adopt immobilized microorganism m

4、ethod to deal with the PTA wastewater. Through the experiment is mixed by 2% sodium alginate and 0.45% carbon nano-material of embedding PTA degradation bacterium make the PTA degradation rate achieve maximum. Immobilize

5、d PTA degrading bacteria optimum temperature is 30 ℃,the optimal pH is 7.At the same time through Fixed bed treatment get the PTA degradation rates achieve maximum when immobilized PTA d</p><p>　　Key words:

6、PTA degrading bacteria；immobilization；carbon nano-material</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言2</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p

7、>　　2.1 材料與儀器3</p><p>　　2.1.1 儀器3</p><p>　　2.1.2 材料3</p><p>　　2.2 實驗方法3</p><p>　　2.2.1 菌種培養(yǎng)3</p><p>　　2.2.2 胞內(nèi)酶胞外酶的確定的研究4</p><p>　　2.2

8、.3 不同環(huán)境下固定化細胞降解PTA的研究5</p><p>　　2.2.4 固定床降解PTA的研究5</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析6</b></p><p>　　3.1 胞內(nèi)酶胞外酶的確定6</p><p>　　3.2 不同量的碳納米材料對固定化細胞降解PTA的影響6</p>&l

9、t;p>　　3.3 不同溫度對固定化細胞降解PTA的影響7</p><p>　　3.4 不同pH對固定化細胞降解PTA的影響8</p><p>　　3.5 固定床降解PTA的工藝處理研究8</p><p>　　3.5.1 不同濃度PTA對固定化細胞降解能力的影響8</p><p>　　3.5.2 不同高徑比對固定化細胞降解情況的

10、影響9</p><p>　　3.5.3 不同流速對固定化細胞降解情況的影響9</p><p><b>　　4 結(jié)論10</b></p><p><b>　　參考文獻11</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1

11、 前言</b></p><p>　　1.1 對苯二甲酸的研究現(xiàn)狀</p><p>　　對苯二甲酸(PTA)是一種重要的化工原料，目前廣泛應(yīng)用于合成樹脂、滌綸纖維、塑料薄膜、增塑劑和染料等行業(yè)[1]。PTA在廣泛應(yīng)用的同時，大量進入自然環(huán)境中，據(jù)報道，我國目前PTA的產(chǎn)量大約在450萬噸以上，產(chǎn)生的廢水卻有1800萬噸，而且PTA的產(chǎn)量又在逐年增加，從而PTA廢水的排放量也會大大

12、增加。而目前處理PTA廢水的工藝，主要以二段好氧及AO等工藝為主[2-4]。</p><p>　　這些工藝普遍存在停留時間長、處理負荷低、基建投資和處理成本高等問題。近年來國內(nèi)外越來越多的企業(yè)和研究機構(gòu)都開始加大對PTA廢水的生物處理研究[5-7]，但如今還不能進行得到大規(guī)模運用。</p><p>　　1.2 對苯二甲酸降解菌固定化方面的研究</p><p>　　微

13、生物固定化技術(shù)是生物工程領(lǐng)域的一項新興技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于制藥、化工、食品發(fā)酵及環(huán)保等領(lǐng)域。近年來在廢水處理中采用固定化微生物技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注，且取得一定的成果。它和傳統(tǒng)的懸浮生物處理法相比，具有處理效率高、穩(wěn)定性強、保持高效菌種、生物濃度高、耐沖擊、污泥生成量少、固液分離效果好等特點[8]。固定化微生物處理廢水的主要特點是設(shè)備小型化，系統(tǒng)化并節(jié)省運行費用。</p><p>　　而如今固定化對苯二甲酸降

14、解菌的方法主要有硅藻土吸附固定化微生物[9]、PVA包埋固定化[10]等。他們在實驗室中都得到了很好的成效，硅藻土吸附固定化微生物則是利用其具有孔隙率高、比表面積大、比重小、吸附性強、化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)異的理化性質(zhì)，而且其在處理工業(yè)廢水和凈化飲用水方面的技術(shù)已經(jīng)有20年左右的歷史[11]。以硅藻土作為細菌的載體，制成吸附固定化微生物來處理污水。而PVA固定化微生物的特點主要有外密內(nèi)疏的多空結(jié)構(gòu)，顆粒具有良好的機械強度和通透性，且制作方法簡

15、單，耐用，而且其中使用的系統(tǒng)啟動性快，耐沖擊，便于連續(xù)化和自動化控制等特點，而且到pH≥3.5時，該系統(tǒng)處理PTA廢水時不用調(diào)節(jié)pH，節(jié)省堿的消耗及運行費用。</p><p>　　1.2 本課題研究內(nèi)容與意義</p><p>　　本實驗主要是對苯二甲酸降解菌進行固定化處理，同時在固定化顆粒中摻雜入碳納米材料進行研究和工藝處理[12-15]。分別在不同溫度、pH、細菌量的情況下研究該固定化菌

16、處理TA溶液，從而確定最佳的固定化條件。</p><p>　　由于目前在治理PTA生產(chǎn)廢水方法大多數(shù)具有占地面積大、投資和運行費用高、處理效率低的缺點，本實驗采用人工篩選高效降解菌種并固定化處理PTA廢水，對于提高處理效果，節(jié)省投資，降低運輸費用具有積極意義。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>

17、;　　2.1 材料與儀器</b></p><p><b>　　2.1.1 儀器</b></p><p>　　本研究所采用的主要儀器和設(shè)備如表1所示。</p><p>　　表1 主要儀器和設(shè)備</p><p><b>　　2.1.2 材料</b></p><p>

18、　　2.1.2.1 菌種</p><p>　　菌種為假單胞菌由實驗室提供。</p><p>　　2.1.2.2 藥品</p><p>　　本實驗所采用的主要藥品如表2所示。</p><p>　　表2 主要實驗藥品</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><

19、;p>　　2.2.1 菌種培養(yǎng)</p><p>　　2.2.1.1 斜面培養(yǎng)基的配方</p><p>　　表3 斜面培養(yǎng)基配方</p><p>　　用鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.0左右，在0.1Mpa，121℃的滅菌鍋滅菌20min。</p><p>　　2.2.1.2 菌體保存</p><p>　　接種環(huán)取菌種劃線于新

20、鮮斜面上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，待菌體生長旺盛，將斜面放在4℃的冰箱中低溫保藏。</p><p>　　2.2.1.3 液體培養(yǎng)基配方</p><p>　　用于做對苯二甲酸降解菌液體培養(yǎng)基成分如表4所示。</p><p>　　表4 液體培養(yǎng)基成分</p><p>　　2.2.1.4 菌體制備</p><p><b

21、>　　（1）斜面種子活化</b></p><p>　　取斜面保藏菌種介于新鮮斜面上，在30℃恒溫下培養(yǎng)。</p><p><b>　?。?）菌體培養(yǎng)</b></p><p>　　取1-2環(huán)在斜面活化后的細菌接種入裝有100mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，</p><p>　　30℃，140r/min的搖

22、床振蕩養(yǎng)48h。</p><p><b>　?。?）菌體細胞獲得</b></p><p>　　將培養(yǎng)48小時的細菌培養(yǎng)液在10000r/m離心10min，收集菌體細胞。用5倍體積的生理鹽水洗滌，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心，共3次，收集沉淀，即為菌體細胞。</p><p>　　2.2.2 胞內(nèi)酶胞外酶的確定的研究</p>

23、<p>　?。?）胞內(nèi)酶、胞外酶的提取</p><p>　　將培養(yǎng)48h的培養(yǎng)液在240nm下測其吸光度，算出對苯二甲酸的含量。然后在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心分離10min，收集上清液，定為胞外酶。用5倍體積的生理鹽水洗滌沉淀，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心，離心3次，收集沉淀，定為胞內(nèi)酶。</p><p>　　（2）胞內(nèi)、胞外酶的確定</p&g

24、t;<p>　　取6個培養(yǎng)瓶，分別貼上標簽，在3個培養(yǎng)瓶中加入50mL胞外酶的上清液。向胞外酶液中加入PTA，使該酶液的PTA濃度為0.1g/L，同時也向另外3個裝有等量胞內(nèi)酶的培養(yǎng)瓶中加入0.1g/L的PTA溶液50mL，然后將6個培養(yǎng)瓶放入30℃、140r/min的搖床中振蕩。分別在1h，2h，4h，24h測其在240nm下的吸光度，測出其降解率。</p><p>　　2.2.3 不同環(huán)境下固定

25、化細胞降解PTA研究</p><p>　?。?）不同量的碳納米材料對固定化細胞降解PTA的研究</p><p>　　將培養(yǎng)48小時的細菌離心清洗收集菌體細胞（菌體濕重為1.016g）。將10mL生理鹽水加入收集的菌體細胞中混勻。同時用生理鹽水配置質(zhì)量分數(shù)為2%的海藻酸鈉水溶液200ml，分成5份，分別加入質(zhì)量分數(shù)分別為0%、0.15%、0.3%、0.45%、0.6%、0.75%的碳納米材料

26、，制備成不同比例的海藻酸鈉碳納米材料混合溶液，同時向每個混合液中加入2mL細菌溶液。混合均勻后，用注射器取上述溶液滴入質(zhì)量分數(shù)為2%CaCl2溶液中固化為鈣凝膠球，即為我們所要的固定化細菌。固定處理2h后，用生理鹽水清洗3-4遍，最后分別加入含有0.1g/L的對苯二甲酸的生理鹽水中（溶液pH為7），在30℃、140r/min搖床下震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)1h、2h、4h、24h后，在240nm下，以蒸餾水做空白，測其的吸光度。</p>

27、;<p>　　（2）固定化細胞降解PTA的最適溫度的研究</p><p>　　將培養(yǎng)48小時的細菌離心清洗收集菌體細胞（菌體濕重為0.989g）。然后將細菌加入到海藻酸鈉為2%，碳納米材料為0.45%的混合溶液中，將其滴入2% CaCl2溶液中得到固定化細菌。取15個培養(yǎng)瓶，將其分成5組，每組有3瓶。在每個瓶中加入濃度為0.1g/L的PTA溶液50mL（PTA溶液pH為7）。貼上對應(yīng)的溫度標簽。向每

28、個培養(yǎng)瓶中加10mL的對苯二甲酸固定化細胞，在20、25、30、35、40℃的溫度下分別作靜態(tài)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1h、2h、4h、24h時在240nm下，以蒸餾水做空白，測其的吸光度。</p><p>　　（3）固定化細胞降解PTA的最適pH的研究</p><p>　　將培養(yǎng)48小時的細菌離心清洗收集菌體細胞（菌體濕重為1.105g）。然后將細菌加入到海藻酸鈉為2%，碳納米材料為0.45%的

29、混合溶液中，將其滴入2% CaCl2溶液中得到固定化細菌。取15個培養(yǎng)瓶，將其分成5組，每組3瓶，貼上對應(yīng)的pH標簽。配置pH分別為5、6、7、8、9，濃度為0.1mol/L的PTA溶液，加入對應(yīng)的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中加入50mL。向每個培養(yǎng)瓶中加入10mL對苯二甲酸固定化細胞。然后在30℃、140r/min搖床下震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1h、2h、4h、24h時在240nm下，以蒸餾水做空白，測其的吸光度。</p><

30、;p>　　2.2.4固定床降解PTA的研究</p><p>　?。?）制備固定化細菌</p><p>　　將培養(yǎng)48小時的細菌離心清洗收集菌體細胞（菌體濕重為2.305g）。然后將細菌加入到海藻酸鈉為2%，碳納米材料為0.45%的混合溶液中，將其滴入2% CaCl2溶液中得到固定化細菌。固定2h后清洗3遍即可使用。</p><p>　?。?）固定床下不同濃度P

31、TA降解情況研究</p><p>　　將處理好的固定化細胞加入固定床中，高徑比30:1，調(diào)整好固定床。分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8g/L的PTA溶液各50mL分別進行上樣。流速為10mL/min，其中PTA溶液是用生理鹽水配置而成。收集的液體重新回到貯液器中，如此循環(huán)往復(fù)。分別測得240nm下不同時間段的吸光值。</p><p>　?。?）不同高徑比下固定化細胞降解PTA的研

32、究</p><p>　　將處理好的固定化細胞按加入到固定床中，使得固定床的高徑比分別為15:1、20:1、30:1、40:1，調(diào)整好固定床。使用PTA濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進行上樣，流速為10mL/min。收集的液體重新回到貯液器中，如此循環(huán)往復(fù)。分別測得在240nm下不同時間的吸光值。</p><p>　?。?）不同流速下固定化細胞降解PTA的研究</p>

33、<p>　　將處理好的固定化細胞按加入到固定床中，高徑比為30:1，調(diào)整好固定床。使用濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進行上樣，流速分別為10、20、30、40mL/min。收集的液體重新回到貯液器中，如此循環(huán)往復(fù)。分別測得在240nm下不同時間的吸光值。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 胞內(nèi)酶胞外酶的確

34、定</p><p>　　從圖1可以明顯看出在相同的時間內(nèi)胞內(nèi)酶的降解速率遠遠大于胞外酶的降解速率，而且胞內(nèi)酶在4h內(nèi)幾乎把全部的PTA降解完全，從而看出對苯二甲酸降解菌的降解酶存在于細胞內(nèi)部。</p><p>　　3.2不同量的碳納米材料對固定化細胞降解PTA的影響</p><p>　　將含有質(zhì)量分數(shù)分別為0%、0.15%、0.3%、0.45%、0.6 %、0.75

35、%的碳納米材料固定化細胞分別加入到PTA溶液為50mL培養(yǎng)瓶，PTA溶液濃度為0.1g/L。.在相同條件下震蕩培養(yǎng)，分別在1h、2h、4h、24h測得吸光度，計算PTA濃度。結(jié)果如圖2所示。</p><p>　　從圖2可以看出，該固定化細胞降解率隨著降解時間的延長而增大。而其中沒有摻雜碳納米材料的固定化細胞降解率最差，而摻雜了碳納米材料的固定化細胞降解率都比沒摻雜前的固定化細胞強，其中碳納米材料質(zhì)量分數(shù)為0.45

36、%的固定化細胞降解率最好。由此可以看出，摻雜碳納米材料對固定化細胞降解率的提高有一定的作用。</p><p>　　3.3不同溫度對固定化細胞降解PTA的影響</p><p>　　將處理好的固定化細胞分別按相同的比例分配到裝有50mL的PTA溶液的培養(yǎng)瓶中，PTA溶液的濃度為0.1g/L。將其放入溫度分別為20、25、30、35、40℃的水浴鍋中培養(yǎng)，分別在1h、2h、4h、24h測得吸光度

37、，計算PTA濃度。結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　從圖3可以看出溫度的過高或過低，都會使得細胞的活性降低，但是當溫度過高時，分子運動加劇，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化，部分細菌發(fā)生不可逆失活，固定化細胞的活力損失力度加大。使得固定化細胞的降解能力急劇下降。綜上所述，固定化細胞降解PTA的環(huán)境溫度不宜過高，可以確定固定化細胞降解的最適溫度為30℃。</p><p>　　3.4不同pH對固定化細

38、胞降解PTA的影響</p><p>　　將處理好的固定化細胞分別按相同的比例分配到裝有50mL的PTA溶液的培養(yǎng)瓶中，PTA溶液的濃度為0.1g/L。將其放入pH分別為5、6、7、8、9的PTA溶液中培養(yǎng)，分別在1h、2h、4h、24h測得吸光度，計算PTA濃度后進行比較。結(jié)果如圖4所示。</p><p>　　從圖4可以看出，pH值低于7時，固定化細胞的降解PTA的能力逐漸變差，而當pH大

39、于7，并逐漸升高時，固定化細胞降解PTA的能力同樣逐漸變差。因此固定化細胞在pH為7時的降解PTA的能力最大。</p><p>　　3.5固定床降解PTA的工藝處理研究</p><p>　　3.5.1不同濃度PTA對固定床降解能力的影響</p><p>　　固定床高徑比為30:1，分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8g/L的PTA溶液各50mL分別進行上樣。流

40、速為10mL/min，其中PTA溶液是用生理鹽水配置而成。收集的液體重新回到貯液器中，同時計算PTA在12h的降解率。結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　從圖5可以看出，當PTA濃度在0.2～0.6g/L時固定化細胞在12h內(nèi)對PTA的降解率基本相同，但是PTA濃度為0.6g/L時降解率有少許降低，當PTA濃度為0.8g/L時降解率有明顯下降。由此得出當固定化細胞中PTA濃度為0.2～0.4g/L是降解率達到最

41、大。</p><p>　　3.5.2不同高徑比對固定化細胞降解情況的影響</p><p>　　固定床高徑比(柱高與內(nèi)徑的比值)分別為15:1、20:1、30:1、40:1，調(diào)整好固定床。PTA濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進行上樣，流速為10mL/min。分別測得在240nm下1～12h的吸光值，同時計算出TA濃度。結(jié)果如圖6所示。</p><p>　　從圖

42、6明顯可以看出，高徑比逐漸增大，固定化細胞對PTA的降解速率也逐漸升大。由此判斷高徑比越大，固定化細胞對PTA的降解速率也會隨之變大。</p><p>　　3.5.3不同流速對固定化細胞降解情況的影響</p><p>　　高徑比為30:1，濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進行上樣，流速分別為10、20、30、40mL/min。分別測得在240nm下1～12h的吸光值。結(jié)果如圖7所示。

43、</p><p>　　從圖7可以看出，當流速低于或者高于30mL/min時，固定化細胞的降解能力都逐漸降低，由此可知當流速為30mL/min時，為固定化細胞降解PTA的最適流速。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　綜上所述，該對苯二甲酸降解菌的降解酶存在于細胞內(nèi)部，屬于胞內(nèi)酶。而當0.45%碳納米材料與2%海藻酸

44、鈉混合固定化包埋細菌時，固定化細胞的降解率最大。其固定化細菌降解PTA的最適溫度為30℃，最適pH為7。同時通過固定床反應(yīng)器中測得PTA溶液流經(jīng)固定化細胞的流速為30mL/min，PTA溶液濃度在0.2～0.4g/L之間時，固定化細胞的降解效率最高，同時當層析柱高徑比越大PTA溶液的降解率也越大。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1

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