水產養(yǎng)殖環(huán)境中菊酯類農藥微生物降解菌的篩選及初步鑒定【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　水產養(yǎng)殖環(huán)境中菊酯類農藥微生物降解菌的篩選及初步鑒定</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物工程 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目

3、錄</b></p><p><b>　　中英文摘要</b></p><p><b>　　引言2</b></p><p><b>　　1.實驗部分2</b></p><p>　　1.1 實驗材料2</p><p>　　1.1.1 樣品來源

4、2</p><p>　　1.1.2 主要溶液和試劑2</p><p>　　1.1.3 培養(yǎng)基2</p><p>　　1.1.4 實驗儀器2</p><p>　　1.2 實驗方法3</p><p>　　1.2.1 菌株的富集和分離3</p><p>　　1.2.2 菌液中菊酯類農藥降解

5、率的測定3</p><p>　　1.2.3 菌株16s rRNA序列的PCR擴增與克隆3</p><p><b>　　2結果與討論4</b></p><p><b>　　2.1 菌落4</b></p><p>　　2.2 菌株降解率的測定4</p><p>　　2.

6、3 菌株的初步鑒定5</p><p>　　2.3.1基因克隆檢測結果5</p><p>　　2.3.2 同源性比較5</p><p>　　2.3.3 16S rRNA序列系統(tǒng)進化樹的分析5</p><p>　　2.3.4革蘭氏染色6</p><p><b>　　3結論7</b><

7、/p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻7</b></p><p>　　摘要：擬除蟲菊酯類農藥是一類高效、廣譜農藥，在水產養(yǎng)殖過程中常用于殺滅寄生蟲等，從而導致養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖生物中該類農藥殘留超標，影響人類健康。本研究從海水及底泥的富集培養(yǎng)物中分離獲得一株可降解氯氰菊酯和溴氰菊酯的菌株，進一步利用氣相色譜法

8、對分離菌株的降解能力進行測定，結果表明，在28oC溫度下，對濃度為100mg/L的氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率分別為94.3％和97.7％，通過革蘭氏染色和16S rRNA序列分析，初步鑒定為噬甲基菌。</p><p>　　關鍵詞：擬除蟲菊酯；降解菌；生理特性；降解率</p><p>　　Abstract：Pyrethroid insecticides as a kind of pestic

9、ide is just after organophosphate and carbamate ester, which is widely used in planted crop with its high-efficiency and low-toxic. But the remaining pesticides will go into human body through the biologic chain and affe

10、ct human health. A pyrethroids degrading bacteria strain was isolated from seawater and sediment. The degrading ability of bacteria were detected by the GC-ECD. The results showed that the strain was able to dgrade cyper

11、methrin </p><p>　　Keywords：Pyrethroid; Degrading bacterium; Physiological characteristic; Degradation rate</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　擬除蟲菊酯類農藥是殺蟲劑中第三大類，為目前僅次于有機磷、氨基甲酸酯的

12、一類殺蟲劑，約占殺蟲劑總量的20℅[1]。其中使用較廣泛的主要有氯氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯菊酯、甲氰菊酯等。其中氯氰菊酯和溴氰菊酯使用最為廣泛，但其比較穩(wěn)定，不易被對光、熱分解[2]，由于長期大量使用的已經造成了生態(tài)系統(tǒng)的嚴重破壞。溴氰菊酯對魚類具有強毒性[3]，可在40 °C以下存放六個月無分解，遇堿分解，無抗藥性。擬除蟲菊酯類農藥具有高效廣譜、作用迅速、持效長等特點，特別是對有機磷農藥已產生抗性的害蟲有很好的效果[4]。擬除

13、蟲菊酯類農藥廣泛應用于農作物如茶樹、蔬菜、果樹、棉花等生產中的害蟲防治。在水產養(yǎng)殖中主要是清塘、毒殺雜魚和有害生物以及殺滅寄生蟲等[5]。由于其在漁業(yè)生產中的廣泛使用，在養(yǎng)殖水環(huán)境以及養(yǎng)殖水產品中存在不同程度的殘留[6]。蓄積在水產品中的農藥將會通過食物鏈進入人體，因而嚴重影響消費者的健康。市售養(yǎng)殖水產品不同程度存在擬除蟲菊酯類農藥的污染。蔣長征、戎江瑞[6]等對寧波市養(yǎng)殖水產品擬除蟲菊酯類農藥的殘留問題進行調查，結果顯示，在魚、蝦、蟹

14、類中氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等都存在不同程度的超標情況。</p><p>　　有些微生物可降解除草劑、多環(huán)芳烴、石油、殺菌劑、人工合成高分子化合物，通過篩選降解菌可為受污染的土壤和水體的生物修復提供一條有效的途徑。對于農藥微生物降解的研究始于本世紀40年代，相對而言，用微生物降解方法解決農藥殘留問題是個較新的研究領域[7]。隨著人民生活水平的提高，食品中農藥殘留的問題越來越受到人們的關注，用微生物降解方法解決

15、農藥殘留問題可為綠色食品生產提供一條新的途徑[8]。有關農藥微生物降解的研究，在對有機磷和有機氯的降解方面的研究較多，對于菊酯類農藥的研究較少。而對于可降解菊酯類農藥微生物的研究主要集中在農作物中，對于水產環(huán)境中的研究比較少[9]。生物修復是指生物尤其是微生物催化降解環(huán)境污染物，減少或最終消除環(huán)境污染的受控或自發(fā)過程，其基礎是自然界中微生物對污染物的生物代謝作用[10]。將農藥降解菌應用于水產環(huán)境的生物修復是目前國內外研究的重點。隨著研

16、究的發(fā)展，被發(fā)現的降解農藥的微生物種類不斷增多，對其降解機理的研究也日趨深入，降解菌降解效果的穩(wěn)定性也日趨提高，目前國內已報道過多種具有降解菊酯類農藥能力的微生物[11-13]。許育新[1]等從農藥廠污泥中分離得到一株可降解氯</p><p>　　擬除蟲菊酯類農藥是一類含酯鍵的農藥，具有多個苯環(huán)結構，為具有中等毒性的一類農藥[15]。本實驗利用劃平板劃線法篩選到了一株可降解溴氰菊酯和氯氰菊酯的菌株，并對其降解效率

17、進行了詳細研究，進一步通過革蘭氏染色和16S rRNA分析，初步鑒定該菌株為噬甲基菌屬（Methylophaga marina）。 </p><p><b>　　1.實驗部分</b></p><p><b>　　1.1 實驗材料</b></p><p>　　1.1.1 樣品來源：寧波附近海域取海水、沉積物樣品。</p

18、><p>　　1.1.2 主要溶液和試劑</p><p>　　濃度為20g/L的溴氰菊酯、氯氰菊酯，丙酮、正己烷、氯化鈉、無水硫酸鈉、異辛烷分析純，購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司，引物27f（5′-AGAGGTTTTGATCCTGGCCAG-3′）、1541r（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′）購自南京金斯瑞生物科技有限公司，PCR反應所需的dNTPs、 rTaqDNA聚合酶

19、及PMD-19購自TaKaRa公司。</p><p><b>　　1.1.3 培養(yǎng)基</b></p><p>　　基礎培養(yǎng)基：海洋細菌培養(yǎng)基（pH 7.6）：蛋白胨，5 g；磷酸高鐵，0.01 g；酵母膏，1 g；過濾海水，1000 ml；固體培養(yǎng)基，15 g瓊脂。</p><p>　　富集培養(yǎng)基：海洋細菌培養(yǎng)基中添加氯氰菊酯和溴氰菊酯的混合液

20、，濃度為100 mg/L。</p><p>　　1.1.4 實驗儀器</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋，核酸蛋白定量檢測儀，離心機，氮氣吹干儀，島津GC-2010，電子天平，PCR儀，無菌操作臺，振蕩器，搖床等。</p><p><b>　　1.2 實驗方法</b></p><p>　　1.2.1 菌株的富集和分離&l

21、t;/p><p>　　(1)、將水樣和沉積物樣品經過初步過濾后各取10 ml加入到滅菌后的海洋細菌培養(yǎng)基中，在75 r min-1、30 °C下?lián)u床培養(yǎng)24 h。</p><p>　　(2)、加入氯氰菊酯和溴氰菊酯，使其終濃度為100 mg/L，然后，在120 r min-1，28 °C下繼續(xù)搖床振蕩培養(yǎng)。 </p><p>　　(3)、將水樣和沉積

22、物中通過搖床培養(yǎng)的混合菌接種到平板上，在溫度28 °C，濕度88%下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種到培養(yǎng)基中，28 °C 150 r min-1搖床培養(yǎng)5天。</p><p>　　1.2.2 菌液中菊酯類農藥降解率的測定</p><p>　　利用正己烷/丙酮（1：1，v/v）混合溶劑提取菌液中的氯氰菊酯和溴氰菊酯，通過GC-ECD檢測菌液中的農藥殘留，計算獲得菌株的降解率

23、。</p><p>　　1.2.3 菌株16s rRNA序列的PCR擴增與克隆</p><p>　　1.2.3.1 菌液PCR</p><p>　　采用16S rRNA反應引物27F和1541R進行PCR擴增；PCR反應條件：經過94 °C預變性2 min后，循環(huán)擴增35次：94 °C 30 s，60 °C 30s，72 °C

24、 1 min，循環(huán)結束后72 °C延伸10 min。反應結束后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測。 </p><p><b>　　表1 PCR體系</b></p><p>　　Tab1 PCR systerm</p><p>　　1.2.3.2 瓊脂糖凝膠中DNA片段的回收 </p><p>　　將含有目的DNA片段的瓊脂

25、糖凝膠切下，置于1.5 ml離心管中；按1：3的比例加入300 μl抽提緩沖液；于恒溫水浴中50 °C溫育至凝膠融化，2-3 min混合一次；將濾液轉移至Spin Column內，在6000 r min-1離心，棄濾液；加入2500 μl抽提緩沖液后1200 r min-1離心，棄濾液；向Spin Columm管內加入750 μl淋洗緩沖液，12000 r min-1離心，棄去濾液；12000 r min-1離心1 min，將

26、Spin Columm轉移至無菌1.5 ml離心管并徹底清除離心柱內殘液；向Spin Columm管內加入25 μl滅菌水，靜置1 min，12000 r min-1離心，置于-20 °C下保存。</p><p>　　1.2.3.3 質粒連接</p><p>　　質粒連接體系：PMD19-T Vector 1 μl；回收的PCR片段 4 μl；Solution2 5 μl。將上述

27、反應體系置于PCR儀中16 °C反應1 h。</p><p>　　1.2.3.4 轉化</p><p>　　取100 μl感受態(tài)細胞懸液于1.5 ml EP管中，加入PUC質粒DNA溶液輕輕搖勻，冰上放置30 min；42 °C水浴90 s立即轉到冰上冷卻數分鐘；加入冰預冷的LB液體培養(yǎng)基890 μl，混勻后37 °C振蕩培養(yǎng)1 h，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并

28、表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）；將上述菌液搖勻后取100 μl涂布于含Amp+ 100 μg ml-1的LB固體平板上，37 °C倒置培養(yǎng)16 h；篩選白色菌落置于5 ml含Amp+的LB培養(yǎng)液中，37 °C培養(yǎng)5 h。</p><p>　　1.2.3.5 PCR檢驗及測序</p><p>　　在LB固體平板上挑選白色菌落，利用菌落PCR擴增后，經瓊脂糖凝膠電

29、泳檢測鑒定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定。 </p><p>　　1.2.4 16s rRNA序列系統(tǒng)進化樹分析</p><p>　　Blast序列比對：將測序結果于NCBI上進行Blast比對；繪制系統(tǒng)樹：選擇同源性較高的細菌16S rRNA序列進行比對分析，構建系統(tǒng)進化樹。</p><p><b>　　2結果與討論</b>&l

30、t;/p><p><b>　　2.1 菌落 </b></p><p>　　用涂有農藥的平板從水樣、沉積物中取樣劃平板，通過一段時間的培養(yǎng)，平板上出現了生長較好的菌落，選取較明顯的菌落標號。其中1-9號菌的菌落形態(tài)為：規(guī)律的白色菌落，線條明朗，長勢旺，厚重；10-16號菌落形態(tài)為：生長無規(guī)律，有單菌落，個體不大，散亂在整個平板上，并且有黃色小菌落；17-19號菌落形態(tài)為：生

31、長2天的菌落個體不大，但密集且黏糊在一起，培養(yǎng)5天后菌落成較大圓形，菌落較多。</p><p>　　2.2 菌株降解率的測定 </p><p>　　挑選21株菌28 °C條件下進行搖瓶培養(yǎng)，1-9號菌培養(yǎng)過程中加入溴氰菊酯，終濃度為100 mg/L，10-19號菌培養(yǎng)過程中加入氯氰菊酯，終濃度為100 mg/L，20-21號菌培養(yǎng)過程中同時加入氯氰菊酯和溴氰菊酯，終濃度各為100

32、 mg/L，培養(yǎng)7天后，通過GC-ECD法分析培養(yǎng)基中氯氰菊酯、溴氰菊酯的濃度，計算降解率。</p><p><b>　　表2 微生物降解率</b></p><p>　　Tab2 Microbial degradation rate</p><p>　　結果如表2所示，菌株1-4，6-9號菌可降解溴氰菊酯，其中7號菌降解率最高，為96.2%；菌

33、株10-19號可降解氯氰菊酯，其中16號菌降解率最高，為100.0%；20、21號菌既可降解溴氰菊酯又可降解氯氰菊酯，其中，21號菌對溴氰菊酯和氯氰菊酯降解率分別為97.7%和94.3%，具有較好的降解效果。</p><p>　　2.3 菌株的初步鑒定</p><p>　　挑選3株降解能力較強的菌株7號、16號和21號，通過16S rRNA對三株菌進行初步鑒定。</p>&l

34、t;p>　　2.3.1 基因克隆檢測結果</p><p>　　如圖1所示，以16S rRNA引物擴增后片段大小為1.5 kb左右，與引物設計時理論擴增片段大小相同。</p><p>　　圖1 基因克隆后凝膠電泳圖</p><p>　　Fig1 The result of the gel electrophoresis</p><p>　

35、　2.3.2 同源性比較</p><p>　　如表3所示，7號菌株的16S rRNA序列與紅細菌屬（Rhodobacteraceae bacterium）的序列同源性為100%。16號菌株的16S rRNA序列與噬甲基菌屬（Methylophaga marina）的序列同源性為100%。21號菌株的16S rRNA序列與噬甲基菌屬（Methylophaga marina）strain 222同源性為99%。<

36、;/p><p>　　表3 降解菌的測序和同源性比較</p><p>　　Tab3 Degrading bacterium sequencing and homology comparison</p><p>　　2.3.3 16S rRNA序列系統(tǒng)進化樹的分析</p><p>　　將21號菌株16S rRNA測序結果提交到NCBI上進行Blast

37、，其核苷酸的序列同源性分析結果表明，該菌株的16S rRNA序列與多數噬甲基菌屬（Methylophaga marina）的序列同源性均在99％以上，將其最相近的10個16S rRNA序列構建進化樹，如圖2所示。系統(tǒng)樹整體由2個分支構成，菌株21號處于噬甲基菌（Methylophaga marina）屬部分菌株的系統(tǒng)進化樹的一個分支中，根據16S rRNA的系統(tǒng)進化樹及Blast分析，21號菌屬于噬甲基菌屬（Methylophaga m

38、arina）。</p><p>　　圖2 基于16S rRNA序列同源性構建的菌株21和相關細菌的系統(tǒng)進化樹</p><p>　　Fig2 Phylogonetic tree based on the sequence homology of strains 21 and bacteria related</p><p><b>　　21號菌序列</

39、b></p><p>　　ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATTGACCACAAAGTGGTAAGCGACCTCCCGAAGGTTAGTCTACCTACTT</p><p>　　CTTTTGCAGCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGC</p>

40、;<p>　　GATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTAGCTTTATGGGATTAGCATA</p><p>　　CTCTCGCGAGTTAGCAACCCTTTGTACTAGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCATAAGGGCCATGATGACTTGAC</p><p>　　

41、GTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGGACAGGGG</p><p>　　TTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTAGCGTTCCC</p><p>　　GAAGGCACCAATCC

42、ATCTCTGGAAAGTTCGCTACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCA</p><p>　　CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTT</p><p>　　ATCGCGTTAGCTTCGATACACAAAGAAT

43、AAATTCTCCATACACCTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTA</p><p>　　TCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGTGAGTCGCCTTCGCCACTGATGTTCC</p><p>　　TTCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCCAC

44、TCACCTCTACCACACTCTAGCCATCCAGTATCAAAATG</p><p>　　CAATTTCCCAGGTTGAGCCCGGGATTTCACATCTGACTTAAATAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAT</p><p>　　TAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTT

45、CTTCTATAGGTAACGTCACAGTTG</p><p>　　CAAGGTATTAACTTACAACCTTTCCTCCCTATTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGC</p><p>　　TGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTC

46、AGTCCCAGTG</p><p>　　TGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCTGATATAG</p><p>　　GTTCATCTAATAGCACGAGGTCCGAAGAGCCCCCGCTTTCCTCCGTAGAGCGTATGCGGTATTAGCAGCCGTTTCCGGCT<

47、/p><p>　　GTTGTCCCCCACTACTAGGCAGATCCCTATACATTACTCACCCGTCCGCCACTAATCCGTCTAGCAAGCTAGACTTCATC</p><p>　　GTTCGACTTGCATGTGTTAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTA</p><p>　　2.3.4革蘭氏染色<

48、/p><p>　　對16、21號菌株進行革蘭氏染色生化實驗，表明16、21號菌株是一株革蘭氏陰性菌，這與噬甲基菌屬（Methylophaga marina）特征相符[17]。</p><p>　　圖3 100倍油鏡10倍目鏡下觀察的16號菌株的革蘭氏染色</p><p>　　Fig3 Gram's staining experiment result of st

49、rain 17 by 100 times Oil mirror and 10 times eyepiece</p><p>　　圖4 100倍油鏡10倍目鏡下觀察的21號菌株的革蘭氏染色</p><p>　　Fig4 Gram's staining experiment result of strain 21 by 100 times Oil mirror and 10 times

50、 eyepiece</p><p><b>　　3結論</b></p><p>　　從水產養(yǎng)殖環(huán)境中取樣，經過篩選得到了一株可同時降解氯氰菊酯、溴氰菊酯的農藥降解菌株21號菌，其在28 oC溫度下，對濃度為100 mg/L的氯氰菊酯和溴氰菊酯溶液的降解率分別為94.3％和97.7％。進一步通過16S rRNA序列分析及革蘭氏染色表明菌株21號與噬甲基菌屬同源性為99%

51、，該菌為革蘭氏陰性菌，這與噬甲基菌屬特征相符。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 許育新，戴青華，李曉慧，等．氯氰菊酯降解菌卡朱CDT3的分離鑒定及生理特性研究[J]．農業(yè)環(huán)境科學學報，2004，23（5）：958-963．</p><p>　　[2] 虞云龍，盛國英，傅家謨，等．殺滅菊酯的微生物降解及酶

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