畢業(yè)論文（設(shè)計）皖北麥田土壤解磷菌篩選及解磷能力初步研究

1、<p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘要2</b></p><p><b>　　關(guān)鍵字2</b></p><p><b>　　引言2</b></p><p><b>　　1 材料和方法2</b&g

2、t;</p><p><b>　　1.1 材料2</b></p><p>　　1.1.1 土樣2</p><p>　　1.1.2 培養(yǎng)基2</p><p>　　1.1.3 磷源物質(zhì)3</p><p><b>　　1.2 方法3</b></p><

3、p>　　1.2.1 解磷菌篩選3</p><p>　　1.2.2 解磷菌在固體培養(yǎng)基上溶磷能力的測定3</p><p>　　1.2.3 解磷菌在液體培養(yǎng)基上溶磷量的測定3</p><p><b>　　2 結(jié)果和討論3</b></p><p>　　2.1 菌落形態(tài)觀察3</p><p&g

4、t;　　2.2 菌株在不同磷源固體培養(yǎng)基上的生長活力3</p><p>　　2.3 菌株在三種液體培養(yǎng)基上的溶磷量4</p><p>　　2.4 三種液體培養(yǎng)基中的pH與溶磷量的關(guān)系5</p><p><b>　　3 結(jié)論6</b></p><p><b>　　致謝6</b></p&

5、gt;<p><b>　　參考文獻(xiàn)7</b></p><p><b>　　英文翻譯8</b></p><p>　　皖北麥田土壤解磷菌篩選及解磷能力初步研究</p><p>　　10級農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境專業(yè) </p><p>　　指導(dǎo)老師： 教授</

6、p><p>　　摘要：采用Pikovskay培養(yǎng)基從臨泉麥田中篩選出具有高效解磷能力的菌株四株，將篩選出的菌株在三種不同磷源（磷酸三鈣、磷礦粉、卵磷脂）的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在Pikovskay平板3天后測量解磷菌D/d為1.27~1.65，在液體搖瓶培養(yǎng)中，其解磷率為0.13~20.20mg/L。其中310—1對三種磷源都有較高的解磷效果，有較高發(fā)展?jié)摿?。?03—3和310—3分別對磷酸鈣和卵磷脂有較高

7、解磷率，可作為專性解磷菌株配合單一磷肥施用。</p><p>　　關(guān)鍵字: 解磷菌；不同磷源；溶磷能力</p><p>　　引言：磷是作物生長必不可少的營養(yǎng)元素之一，在作物生長的各個階段都扮演重要角色。根據(jù)報道我國約75%的耕地土壤缺磷。土壤中95%的磷以無效態(tài)形式存在，植物難以直接利用。根據(jù)報道，土壤中平均含磷量約0.12%，而其在土壤溶液中的含量僅為0.005~1.0mg/kg。作物當(dāng)

8、季磷肥利用率僅為5%~10%，大部分磷作為無效態(tài)在土壤中累積[1,2]。由于長期施用磷肥，土壤磷庫充足而磷流不足是目前耕地土壤的現(xiàn)狀。土壤中含磷化合物以有機態(tài)和無機態(tài)的形式存在。無機態(tài)磷約占30%~50%，主要分為閉蓄態(tài)磷和非閉蓄態(tài)磷。閉蓄態(tài)磷是指磷酸鐵和磷酸鋁被氧化鐵形成的酸膜包敝，活性較低，難以被植物利用。非閉蓄態(tài)磷主要指鐵鋁鈣的三種磷酸鹽，在一定條件下他們可以被釋放出來供植物利用[3]。土壤中有機態(tài)磷約占30%~50%，主要包括肌

9、醇類，核酸，磷脂，磷蛋白，磷糖等。土壤中的有機態(tài)磷5%~10%存在于微生物體內(nèi)，30%~50%以植酸鈣鎂的形式存在。土壤很多因素影響磷的利用，其中微生物對磷的有效化影響很大。事實上土壤中存在大量的解磷微生物，能夠?qū)o效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為有效態(tài)磷（可溶性磷）。我國旱地土壤的解磷菌平均為107cfu /</p><p><b>　　1 材料和方法：</b></p><p>&l

10、t;b>　　1.1 材料</b></p><p>　　1.1.1 土樣：臨泉小麥土壤。</p><p>　　1.1.2 培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)基（改良的Pikovskaya培養(yǎng)基）:葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.2g，硫酸鎂0.1g，氯化鉀0.2g，酵母膏0.5g，硫酸錳0.002g，硫酸亞鐵0.002g，0.4%溴酚藍(lán)（pH6.7）6m

11、l，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.0—7.2。</p><p>　　液體培養(yǎng)基：Pikovskaya培養(yǎng)基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，氯化鎂5g，硫酸鎂0.25g，氯化鉀0.2g，硫酸銨0.1g，蒸餾水1000ml，pH7.0。</p><p>　　1.1.3 磷源物質(zhì)：無機磷為磷酸三鈣(Ca3(PO4)2)，磷礦粉: 主要成分為氟—磷灰石。有機磷為卵磷脂。上述均

12、為市售分析純試劑。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 解磷菌篩選：稱取新鮮土壤10g置于內(nèi)含玻璃珠和90ml無菌水的250ml的三角瓶中，170r/min振蕩30min，然后按10-5、10-6、10-7梯度進(jìn)行稀釋，各取0.1ml涂布于分離培養(yǎng)基上，每個梯度重復(fù)3次，于30℃培養(yǎng)3~5d，挑取有較大溶磷圈的菌落進(jìn)行

13、純化保存。用接種環(huán)將上述純化保存的生長良好的解磷菌，使用平板劃線法分別接種于pikovskaya培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d，選取生長良好溶磷圈明顯的菌落，觀察記菌株菌落特征及生長情況。</p><p>　　1.2.2 解磷菌在固體培養(yǎng)基上溶磷能力的測定：用滅過菌的牙簽將上述菌株點接在分別以磷酸三鈣、磷礦粉和卵磷脂為唯一磷源的培養(yǎng)中，磷源為卵磷脂時，不加溴酚藍(lán)，卵磷脂為2g/L，并補加碳酸鈣5g/L。30℃培養(yǎng)3天，測量

14、溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）及其比值。初步確定各菌株解磷能力的強弱。</p><p>　　1.2.3 解磷菌在液體培養(yǎng)基上溶磷量的測定：將上述篩選菌株按1%的接種量分別接入以磷酸三鈣、磷礦粉和卵磷脂為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中，并分別以不接種菌的三種培養(yǎng)基作空白對照，30℃，170r/min搖床培養(yǎng)7d。發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心機離心10min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，分別用鉬藍(lán)比色法和pH計測可溶性磷含

15、量和pH值。</p><p><b>　　2.結(jié)果和討論</b></p><p><b>　　2.1菌落形態(tài)觀察</b></p><p>　　表1 解磷菌的菌落特征</p><p>　　Table 1 Characteristics of colony</p><p>　　經(jīng)

16、過篩選得到4株生長良好的菌株303-1、303-3、310-1、310-3。菌株菌落特征見表1。四菌株菌落都比較大，溶磷圈明顯。與310-1相比，其他三種菌株都為圓形，303-1與303-3為乳白色，310-1與310-3分別為黃色和淡黃色。從生長速度來看，310-3生長相對于其他3株較快，平板培養(yǎng)1d就能看到菌株生長，其他3株兩天后才能看到生長。</p><p>　　2.2菌株在不同磷源固體培養(yǎng)基上的生長活力&

17、lt;/p><p>　　將篩選菌株分別接種在以磷酸三鈣、磷礦粉和卵磷脂為唯一磷源的培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）及D/d值。測量結(jié)果見表2。</p><p>　　表2 固體培養(yǎng)基上解磷菌D、d和D/d值</p><p>　　Table 2 The D, d and D/d values of the phosphate-solubiliz

18、ing bacteria in solid medium</p><p>　　由表2可以看出不同培養(yǎng)基下不同菌株長勢不同。生長最好和生長最差的菌株均在磷酸三鈣培養(yǎng)基上。其中310-1在磷酸三鈣培養(yǎng)基上生長最旺，D和d分別達(dá)到6.2mm和4.8mm。但該菌株在磷礦粉和卵磷脂培養(yǎng)基上長勢均比其他三菌株長勢弱。 310-3在磷酸三鈣上生長最弱，D和d分別僅達(dá)到3.2mm和2.1mm，而在磷礦粉和卵磷脂培養(yǎng)基上長勢第二高

19、。所以磷酸三鈣對菌株選擇性較強。除310-1外，菌株在卵磷脂培養(yǎng)基長勢均超過磷酸三鈣培養(yǎng)基，除310-3外，菌株在磷礦粉培養(yǎng)基上生長均超過卵磷脂培養(yǎng)基。可能是由于不同菌株對不同營養(yǎng)磷源要求不同，而不同培養(yǎng)基提供不同磷源。另外，不同解磷菌在不同磷源培養(yǎng)基上D/d值也不盡相同。303-3和310-1在卵磷脂培養(yǎng)基上D/d值比其他兩種培養(yǎng)基都大，分別達(dá)到1.72和1.67。在表明這兩種菌株對有機磷具有較高的固體溶磷能力，其中尤以310-3突出

20、。310-1和310-3分別在磷礦粉固體培養(yǎng)基上D/d值達(dá)到最大，分別為1.61和1.52。表明310-1對磷礦粉具有較高的固體溶磷能力，而310-3對磷酸三鈣具有較高的固體解離能力。</p><p>　　2.3菌株在三種液體培養(yǎng)基上的溶磷量</p><p>　　將篩選的菌株按1%的接種量接種于不同的磷源培養(yǎng)基，30℃，170r/min搖床培養(yǎng)7d。發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心10mi

21、n，鉬銻鈧比色法測上清液含磷量。結(jié)果見圖1。</p><p>　　圖1 菌株在不同液體磷源培養(yǎng)基中的溶磷量</p><p>　　Figure 1 The amount of dissolved phosphorus in diverse liquid phosphorus medium</p><p>　　由圖1可以看出不同菌株對不同液體磷源的溶磷能力差異極為顯著（

22、P﹤0.01）。四種菌株對磷礦粉的溶解能力相比磷酸鈣和卵磷脂較小，溶磷量分別僅達(dá)到0.11、0.12、2.1和0.03mg/L。當(dāng)以磷酸鈣為唯一磷源時，303-1和310-3的溶磷量僅不足1mg/L，分別為0.47和0.31mg/L。而303-3和310-1的溶磷量明顯高于前者，分別為14.32和7.00mg/L。而以磷礦粉為唯一磷源時，僅310-1有相當(dāng)程度的解磷能力，溶磷量能達(dá)到2.06mg/L，其他三中菌株都最高的不過 0.12m

23、g/L。以卵磷脂為唯一磷源時，310-3菌株溶磷量達(dá)到20.20mg/L。而該菌株對磷礦粉和磷酸三鈣的溶磷量分別為0.03和0.31mg/L?？梢?，303-3對有機磷源的溶磷能力較高，而對無機磷源的溶解能力則遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前者。結(jié)果表明，303-3、310-1和310-3的優(yōu)勢磷源分別磷酸三鈣、磷酸三鈣和卵磷脂，而303-1對三種液體磷源都沒有明顯的溶磷能力。</p><p>　　以上結(jié)果表明，不同菌株對不同磷源的溶解

24、能力差異很大。同一菌株對不同磷源的溶解效果也很不一致。鐘傳青等[12,13]研究比較了細(xì)菌、霉菌、酵母菌等對不同難容性磷源的溶磷效果發(fā)現(xiàn)，不同微生物對不同磷源的親和解磷能力不同，可能是由于微生物本身復(fù)雜的溶磷機制、磷源物質(zhì)的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)差異等多種因素引起的。Illmer等人報道了[11]四株菌株對Ca-P、Al-P、磷礦粉的溶磷效果差異認(rèn)為這種差異是由微生物不同的溶磷機制造成的，并認(rèn)為Al-P是通過形成絡(luò)合物而溶解的。</p&g

25、t;<p>　　2.4三種液體培養(yǎng)基中的pH與溶磷量的關(guān)系</p><p>　　圖2 液體培養(yǎng)基中pH與溶磷量的關(guān)系</p><p>　　Figure 2 The relation between PH and the amount of dissolved phosphorus in liquid medium</p><p>　　相對于原培養(yǎng)液（不

26、接種菌株）pH值為7.25。接種解磷菌后，培養(yǎng)液pH值下降，在4.34~7.20之間。說明解磷菌在溶磷過程中分泌出致酸物質(zhì)，導(dǎo)致pH值下降，使難容性磷溶解。圖2是培養(yǎng)7天的液體培養(yǎng)基pH與可溶性磷增量的關(guān)系。由圖看出，溶磷量越高，則pH值越低，但pH值低溶磷量未必高。這可能與磷源物質(zhì)以及菌株的解磷機制差異有關(guān)。綜合分析四株解磷菌在三種液體培養(yǎng)基中溶磷量與pH值的關(guān)系，pH降低可增加液體培養(yǎng)基中可溶性磷量，但當(dāng)pH相近時，溶磷量差異較大。

27、由表3、表4看出，卵磷脂培養(yǎng)基中pH值下降較多，在6.03~4.34。且pH與溶磷量沒有線性關(guān)系。如303-1和303-3的溶磷量分別為0.5889和1.095mg/L，而pH分別為5.75和5.94。這一結(jié)果與趙曉蓉等的研究結(jié)果一致[1]。而有一些研究發(fā)現(xiàn)，許多溶磷菌溶磷量與pH值有一定的線性相關(guān)。本實驗的磷酸三鈣培養(yǎng)基恰可以證明這一點。有效磷量增加，pH值降低。席林橋等人的研究表明解磷菌在溶解難容性磷的過程中會分泌有機酸[4]，使溶

28、液pH值下降，分泌有機酸的種類取決于解磷菌種類，pH值下降和有機酸生成是解磷菌重要溶磷機理。從表中還可</p><p>　　表3 液體培養(yǎng)基下解磷菌株pH值</p><p>　　Table 3 The pH in phosphate-solubilizing strains liquid medium</p><p>　　表4液體培養(yǎng)基下解磷菌株溶磷量</p&

29、gt;<p>　　Table 4 The amount of dissolved phosphorus in liquid medium</p><p><b>　　3 結(jié)論</b></p><p>　　3.1通過對解磷菌的篩選，解磷菌在不同磷源培養(yǎng)基的生長狀況、溶磷圈的觀察，解磷菌在三種液體磷源培養(yǎng)基上溶磷能力的測定，可以得出不同菌株對在不同磷源的固

30、體培養(yǎng)基上生長狀況以及在不同液體培養(yǎng)基中溶磷效果各有不同，這可能與解磷菌復(fù)雜的溶磷機制、不同磷源物質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異等多種因素有關(guān)。</p><p>　　3.2解磷菌溶解難溶性磷時會分泌酸性物質(zhì)使pH值下降，分泌的酸性物質(zhì)的種類與數(shù)量卻不盡相同，這可能也是導(dǎo)致溶液pH與解磷菌溶磷量沒有線性關(guān)系的原因。</p><p>　　3.3從臨泉麥田中篩選出具有高效解磷能力的菌株四株，將篩選出的菌

31、株在三種不同磷源（磷酸三鈣、磷礦粉、卵磷脂）的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。得到結(jié)果310—1對三種磷源都有較高的解磷效果，有較高發(fā)展?jié)摿?。?03—3和310—3分別對磷酸鈣和卵磷脂有較高解磷率，可作為專性解磷菌株配合單一磷肥施用。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本文在 老師的指導(dǎo)下完成，在實驗設(shè)計，實驗過程及寫作過程中，承

32、蒙汪老師的精心指導(dǎo)，值此論文答辯之際，向尊敬的汪老師致以最真誠的感謝。同時段立珍老師也在我的試驗完成提供了諸多便利，我在此表示衷心的感謝。并感謝左靜、李雪峰、江杰等的熱心幫助，使我的論文順利完成。最后向幫助過我的其他同學(xué)和老師表示由衷的謝意！</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 趙小蓉,林啟美,李保國.溶磷菌對4種難溶性磷酸鹽溶

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38、/p><p>　　[12] 鐘傳青，黃為一.磷細(xì)菌P17對不同來源磷礦粉的溶磷作用及機制[J].土壤學(xué)報, 2004,41(6): 931-936.</p><p>　　[13] 鐘傳青,黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學(xué)報, 2005,42(2): 286-294.</p><p>　　Primary study on isolat

39、ion and ability of phosphorus-solubilizing bacteria in soil of wheat in Northern Anhui</p><p>　　Student majoring in the agriculture resource and environment Zhao Jiayin</p><p>　　Tutor: Wang J

40、ianfei</p><p>　　Abstract: 4 phosphorus-solubilizing bacteria were isolated from soil in Northern Anhui by Pikocskay solid medium. Then put the phosphate-solubilizing bacteria in three different phosphorus so

41、urce (calcium phosphate and phosphate rock powder, lecithin) of solid medium and liquid medium to cultivate. The ratio of D/d values raged from 1.27 to 1.65 after 3 days in Pikocskay solid medium and the ratio of dissolv

42、ing phosphorus varied from 0.13 to 20.20 mg/L in liquid cultivate. In which, strain 310-1</p><p>　　Key words: the phosphate-solubilizing bacteria; source of diverse phosphorus ; ability of phosphorus-solubil