原生質(zhì)體誘變技術(shù)在九州蟲草優(yōu)良菌株選育中的應(yīng)用.pdf

1、蟲草屬[Cordyceps(Fr.)Link]真菌是一大類昆蟲病原真菌,其生活史包括無性型和有性型兩個(gè)階段,即具有世代交替現(xiàn)象。蟲草是昆蟲病原真菌侵染寄主昆蟲所形成的一種特殊形態(tài),其中冬蟲夏草是最為名貴的一種,具有多種藥理作用,主要產(chǎn)于青、川、滇、藏3000-5000米的高原地區(qū);九州蟲草(Cordyceps kyushuensisKob)是1996年在蒙山發(fā)現(xiàn)的一種以豆天蛾(Clanis bilineata Walker)幼蟲為寄主的

2、蟲草,其無性型為九州輪枝菌,研究表明九州蟲草含有多種生物活性物質(zhì),具有很高的藥用價(jià)值。由于冬蟲夏草生長(zhǎng)環(huán)境比較苛刻,產(chǎn)量有限,且價(jià)格昂貴,而九州蟲草已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人工栽培,可以為九州蟲草的深入研究提供豐富的原材料,因此本實(shí)驗(yàn)選擇九州蟲草作為育種研究的對(duì)象。蟲草中核苷類物質(zhì)的含量是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要指標(biāo),因此本研究以蟲草素、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黃嘌呤、鳥苷和尿苷這7種核苷類物質(zhì)作為九州蟲草誘變育種的目標(biāo)物質(zhì)。
　　 本研究以蒙山和沈

3、陽兩個(gè)產(chǎn)地的野生九州蟲草作為原生質(zhì)體誘變育種的親本菌株。第一步,制備兩個(gè)親本菌株的原生質(zhì)體;第二步,對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行紫外線單因子誘變和紫外一亞硝酸復(fù)合誘變,挑取誘變之后得到的原生質(zhì)體再生菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面上進(jìn)一步培養(yǎng),然后通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)得到各誘變菌株的菌絲體;第三步,利用超聲破碎提取法制備九州蟲草親本菌株和誘變菌株菌絲體的水提取液,然后利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法檢測(cè)各水提液中蟲草素、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黃嘌呤、鳥苷和尿苷7種物質(zhì)的含量

4、,通過誘變菌株與親本菌株菌絲體中這7種物質(zhì)含量的比較,得到各種不同的誘變高產(chǎn)菌株,并進(jìn)一步對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè);第四步,利用生化標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳變異研究。
　　 在進(jìn)行第一步時(shí)對(duì)影響原生質(zhì)體制備和再生的因素進(jìn)行了研究,這些因素包括菌絲體的菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度以及酶體系的組成。通過單因子實(shí)驗(yàn)得到原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件為:取菌齡為6 d的菌絲體,用1％蝸牛酶+0.

5、5％纖維素酶(體積比1:2),35℃,酶解2.5 h,所用滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L的MgSO4,所得原生質(zhì)體制備率為1.68×108個(gè)/mL,將原生質(zhì)體懸液涂布在以0.6 mol/L的蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑的固體再生培養(yǎng)基上,得到的再生率為9.32％。
　　 在第二步和第三步實(shí)驗(yàn)中,對(duì)九州蟲草原生質(zhì)體進(jìn)行了紫外線單因子誘變和紫外-亞硝酸復(fù)合誘變后,利用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法篩選得到8株具有遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)菌株,它們分別為菌株U

6、2,U4,U7,U13,H6,H9,H26和H31,其中菌株U13,H6,H9,H26和H31菌絲體中蟲草素的含量分別是親本菌株的2.12,1.69,1.76,1.73和1.41倍;而菌株U2,U4和U7菌絲體中次黃嘌呤、鳥苷和尿苷的含量與親本相比各有不同的提高。
　　 在第四步實(shí)驗(yàn)中利用了酯酶同工酶標(biāo)記技術(shù)和ISSR-PCR技術(shù)對(duì)高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行了遺傳變異研究,二者的分析結(jié)果表明,突變株的酯酶同工酶酶譜和基因組序列與親本菌株不