紅豆杉細胞系種質(zhì)保存及遺傳變異研究.pdf

1、紅豆杉細胞系在繼代培養(yǎng)過程存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，表現(xiàn)在隨著繼代次數(shù)的增加，細胞合成紫杉醇的能力逐漸下降，這嚴重制約著紅豆杉細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫醇的的工業(yè)化進程，對于其不穩(wěn)定性機理已經(jīng)有了一些研究，但尚不明確。因而建立一種穩(wěn)定保存紅豆杉種質(zhì)的方法，可緩解紅豆杉細胞常溫繼代過程中的變異。本研究對紅豆杉細胞低溫緩I曼生長保存及其遺傳變異，以及超低溫保存進行了研究，獲得如下結(jié)果：
　　 1)首先建立了系列抗前體篩選紅豆杉細胞系。通過在培養(yǎng)

2、基中添加苯丙氨酸，苯甲酸鈉和乙酸鈉，經(jīng)半年時間篩選獲得了產(chǎn)量提高了1.35倍的細胞系。
　　 2)對低溫緩慢生長法保存紅豆杉細胞進行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)低溫緩慢生長法保存前后，紅豆杉細胞細胞表觀形態(tài)和紫杉醇產(chǎn)量與對照相比沒有顯著差異，但在恢復培養(yǎng)2個周期后，細胞系發(fā)生了變異，表現(xiàn)在紫杉醇含量下降，且保存時間越長，含量下降越快。
　　 (2)利用反相高效液相檢測技術(shù)(HplC)對低溫保存后恢復培養(yǎng)

3、過程中紅豆杉細胞基因組甲基化水平分析，發(fā)現(xiàn)低溫保存后恢復培養(yǎng)的細胞系的DNA甲基化水平升高，表明細胞培養(yǎng)過程中紫杉醇含量的下降可能與某些基因的甲基化有關(guān)。
　　 3)研究了玻璃化法、預培養(yǎng)干燥法、干燥/玻璃化法三種方法對紅豆杉細胞系進行超低溫保存的可行性，初步建立了紅豆杉細胞超低溫保存體系。
　　 (1)對影響玻璃化超低溫保存的因素進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)預培養(yǎng)方式，冰凍保護劑種類，脫水時間對紅豆杉細胞超低溫保存的存活率有比