小麥-黑麥易位系材料R59中α-硫素基因的cDNA克隆、表達(dá)純化及FTIR研究.pdf

1、目的：克隆小麥—黑麥易位系材料R59中α—硫素基因，并在E．coliBL21(DE3)中表達(dá)純化，然后通過傅里葉變換顯微紅外手段研究在信號(hào)肽缺失的情況下，C末端酸性蛋白的存在對(duì)α—硫素原核表達(dá)過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 方法：通過RT-PCR手段從R59幼苗葉片中擴(kuò)增出α—出硫素基因，克隆測(cè)序。設(shè)計(jì)帶有NcoI和HindⅢ酶切位點(diǎn)的特異引物，對(duì)cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)、信號(hào)肽或C末端缺失的片段(SC、△SC、S△C、△S△C)進(jìn)行P

2、CR擴(kuò)增，并與經(jīng)過相同雙酶切的pET-32a(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)/SC，pET-32a4㈩/△SC，pET-32a㈩/S△C，pET-32a[+)/△S△C。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切及DNA測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，采用SDS-PAGE及Western—blotting鑒定外源蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜(FFIR)手段研究C末端酸性蛋白的存在對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)

3、過程的影響。對(duì)于pET-32a(+)/△S△C中獲得的可溶性蛋白經(jīng)過Ni2+—NTA親和層析柱純化后采用腸激酶酶切，進(jìn)一步通過高效液相色譜(HPLC)分離純化得到目的蛋白。 結(jié)果：R59中α—硫素基因包含一個(gè)408nt，可以編碼136個(gè)氨基酸的開放式閱讀框，其推導(dǎo)的蛋白與小麥、大麥、黑麥硫素的氨基酸同源性為78％～100％。雙酶切及測(cè)序結(jié)果表明：目標(biāo)基因已成功插入表達(dá)載體pET-32a(+)。SDS-PAGE顯示無論是否攜帶C末

4、端酸性蛋白，信號(hào)肽的存在均會(huì)導(dǎo)致外源基因無法在大腸桿菌BL21(DE3)體系中高效表達(dá)；當(dāng)信號(hào)肽缺失時(shí)，C末端酸性蛋白的存在導(dǎo)致融合蛋白主要以包涵體形式存在；而在信號(hào)肽和C末端酸性蛋白都缺失的情況下，外源基因主要以可溶形式表達(dá)。FTIR結(jié)果表明：在包涵體中除了1630cm-1處對(duì)應(yīng)的聚集體特征吸收外，在1654cm-1還觀察到α—螺旋的結(jié)構(gòu)；對(duì)全細(xì)胞紅外光譜的酰胺I帶區(qū)域進(jìn)行傅里葉去卷積處理，結(jié)合高斯曲線擬合，發(fā)現(xiàn)在pET-32a(+)

5、/△SC樣品中隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，聚集體含量逐漸增加，這與SDS-PAGE結(jié)果一致。此外，伴隨著聚集體的形成，α—螺旋的含量逐漸增加；而p．折疊和無規(guī)卷曲的含量卻逐漸減少。在pET-32a(+)/△s△c樣品中觀察到無規(guī)卷曲的含量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加逐漸提高，而β—轉(zhuǎn)角及1629±1era-1處對(duì)應(yīng)的β—折疊的含量卻逐漸減少。 結(jié)論：攜帶信號(hào)肽的片段在大腸桿菌中均不能成功表達(dá)。在信號(hào)肽缺失情況下，C末端酸性蛋白的缺失可以提高融合蛋白