豬丁型冠狀病毒感染率調(diào)查、全基因組克隆及進(jìn)化分析.pdf

1、丁型冠狀病毒(Deltacoronavirus)是2009年發(fā)現(xiàn)和在2011年正式劃分的第四種冠狀病毒屬，其屬內(nèi)的病毒基因組特征與其他冠狀病毒屬有較大差異。豬丁型冠狀病毒(porcine delta coronavirus，PDCoV)是一種新型豬冠狀病毒，與PEDV和TGEV類似，PDCoV能夠引起豬的腸道疾病，導(dǎo)致腹瀉、嘔吐和脫水，尤以哺乳階段仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重。
　　自2011午香港首次發(fā)現(xiàn)該病毒以來，在美國，韓國均已有PDC

2、oV發(fā)病報道，給各國養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大隱患，而我國內(nèi)地暫未有相關(guān)報道。
　　本研究首先建立了實(shí)時熒光定量PCR用于特異性地檢測PDCoV;通過該方法對2014年來自我國浙江、江蘇、河南等10個省份的豬臨床病料包括糞便和小腸勻漿進(jìn)行檢測，并進(jìn)行感染率調(diào)查;對獲得的三個陽性樣本進(jìn)行PDCoV全長基因組擴(kuò)增并克隆，為后續(xù)的建立PDCoV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)打下了基礎(chǔ)。
　　1、PDCoV實(shí)時熒光定量PCR檢測方法建立
　　檢測并獲得四

3、川毒株陽性樣本，以其片段作為標(biāo)準(zhǔn)品建立實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，確定最優(yōu)的PCR引物與熒光定量探針、退火溫度、循環(huán)數(shù)，樣本添加濃度等條件。
　　2、PDCoV感染率調(diào)查
　　從我國10個省份254份樣本中檢出了來自湖南、江蘇兩地的11個陽性樣本。PDCoV綜合檢出率4.33％，PEDV共感染率72.73％，表明我國內(nèi)地已有PDCoV存在。
　　3、中國PDCoV全長基因組的獲得與序列比對
　　對江蘇、湖南、四川

4、的代表性PDCoV毒株進(jìn)行克隆，獲得三條中國PDCoV全長基因組序列并進(jìn)行分析比對。其中四川毒株已登錄GenBank，其GenBankaccession number是KT266822。與其他國家地區(qū)PDCoV序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)四川毒株S27在ORF1a區(qū)域有兩個特有的片段缺失，分別與HKU15-44和HKU15-155有著98.8％和99.1％的序列相似度，同時與美國各PDCoV毒株有著98.9到99.0％的序列相似度。由此可見，S2

5、7在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上親緣關(guān)系介于HKU15和美國毒株之間。它的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了2012年香港毒株公布之后至2013年北美PDCoV發(fā)現(xiàn)之前的空白，可能能夠揭示PDCoV傳播至北美的過程。湖南毒株與四川毒株親緣關(guān)系非常相近，在ORF1a區(qū)域有一個片段缺失。江蘇毒株填補(bǔ)了HKU15的兩個毒株之間的跨度，分化時間非常早，可能在PDCoV首次發(fā)現(xiàn)時就研究存在。
　　我國在湖南、四川、湖北等地也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了新的PDCoV毒株，分析表明中國香港及大陸各地