蘇姜豬初情期啟動(dòng)基因的發(fā)育性變化及差異顯示研究.pdf

1、初情期是動(dòng)物首次出現(xiàn)發(fā)情排卵的年齡，是開始獲得繁殖能力的標(biāo)志。初情期的啟動(dòng)，是由下丘腦GnRH神經(jīng)元控制。從目前的研究報(bào)道看，初情期啟動(dòng)的機(jī)制實(shí)際上是GnRH脈沖式釋放的調(diào)控，是非類固醇介導(dǎo)的中樞機(jī)制，調(diào)控因素包括神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)類固醇。主要參與調(diào)控GnRH釋放的神經(jīng)肽有鴉片肽、NPY、促生長激素神經(jīng)肽(Galanin)、促皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)；神經(jīng)遞質(zhì)有去甲腎上腺素(NE)、多巴胺、5-羥色胺、褪黑激素、γ氨基丁酸(GAB

2、A)，但其具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。目前，關(guān)于初情期啟動(dòng)相關(guān)基因受體NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的研究報(bào)道較少，特別是關(guān)于他們對(duì)初情期啟動(dòng)的調(diào)控機(jī)制幾乎沒有報(bào)道。本研究系統(tǒng)的研究初情期啟動(dòng)相關(guān)基因受體NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因在下丘腦-垂體-卵巢內(nèi)的組織定位及其組織發(fā)育性變化，目的是為深入研究探討NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb在初情期啟動(dòng)中扮演的角色。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還采用mRNA差異顯示(mRNADD)

3、技術(shù)對(duì)豬初情期啟動(dòng)的關(guān)鍵因子做進(jìn)一步的研究，以篩選與豬初情期啟動(dòng)相關(guān)的重要基因。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)GenBank發(fā)表的序列設(shè)計(jì)NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的部分cDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEM-T easy載體中進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果：與發(fā)表的豬NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因序列(NO.AF10

4、6081，NO.DQ459346，NO.AF092422)同源性均為100％，說明所擴(kuò)增的序列為本實(shí)驗(yàn)所要的，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.用原位雜交技術(shù)檢測(cè)蘇姜豬母豬初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘腦、垂體和卵巢的分布定位。結(jié)果：在蘇姜豬初情期前后下丘腦、垂體和卵巢三種組織中，均檢測(cè)到NPY-Y1 mRNA陽性雜交信號(hào)。下丘腦的陽性雜交信號(hào)主要集中在丘腦室旁核和下丘腦的弓狀核、室旁核、室周核等處；在垂體中分布相對(duì)密集

5、；各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞中均有陽性雜交信號(hào)，間質(zhì)中也有少量的雜交信號(hào)。在三種組織中NPY-Y1 mRNA雜交信號(hào)均初情期較弱，初情期前相對(duì)較強(qiáng)。結(jié)果可以初步證明NPY-Y1在下丘腦-垂體-卵巢軸對(duì)雌性生殖的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，并且對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸具有調(diào)控作用。
　　 3.用原位雜交技術(shù)檢測(cè)蘇姜豬母豬初情期前后GPR54 mRNA在下丘腦、垂體和卵巢的分布定位。結(jié)果：在蘇姜豬初情期前后下丘腦、垂體和卵巢三種組織中，

6、均檢測(cè)到GPR54 mRNA陽性雜交信號(hào)。下丘腦的陽性雜交信號(hào)主要集中在弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核中，其它區(qū)也有一定的表達(dá)；在垂體中分布相對(duì)密集；各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞中均有陽性雜交信號(hào)，間質(zhì)中也有少量的雜交信號(hào)，大卵泡的陽性率明顯高于小卵泡。在三種組織中GPR54 mRNA雜交信號(hào)均初情期較強(qiáng)，初情期前相對(duì)較弱些。結(jié)果可以初步證明GPR54在下丘腦-垂體-卵巢軸對(duì)雌性生殖的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，并且對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸具有調(diào)控作用。<

7、br>　　 4.用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定蘇姜豬母豬初情期前后下丘腦、垂體、卵巢內(nèi)Ob-Rb的分布及定位。結(jié)果：Ob-Rb陽性顆粒廣泛分布于下丘腦，尤其是弓狀核；垂體中Ob-Rb陽性顆粒主要集中于垂體前葉細(xì)胞；卵巢中Ob-Rb陽性顆粒出現(xiàn)在各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞，而卵母細(xì)胞沒有陽性顆粒。結(jié)果可以初步證明Ob-Rb在下丘腦-垂體-卵巢軸對(duì)雌性生殖的調(diào)節(jié)中也具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。
　　 5.用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)蘇姜豬初生、60、120

8、、初情期、180日齡五個(gè)不同發(fā)育階段的下丘腦、垂體和卵巢三種組織中NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb mRNA的表達(dá)豐度變化。結(jié)果：(1)下丘腦、垂體與卵巢內(nèi)NPY-Y1 mRNA表達(dá)量從初生到初情期表達(dá)量逐漸下降，在初情期達(dá)到最低，初情期后呈上升趨勢(shì)。下丘腦內(nèi)各個(gè)時(shí)期NPY-Y1 mRNA表達(dá)量均存在顯著差異(P＜0.05)，垂體內(nèi)120日齡與180日齡之間NPY-Y1 mRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，其它時(shí)期NpY-Y1

9、 mRNA表達(dá)量均顯著差異(P＜0.05)，卵巢內(nèi)初情期與180日齡之間NPY-Y1 mRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，其它時(shí)期NPY-Y1 mRNA表達(dá)量均顯著差異(P＜0.05)。(2)下丘腦、垂體與卵巢內(nèi)GPR54 mRNA表達(dá)量均從初生到初情期表達(dá)量逐漸上升，在初情期達(dá)到最高，初情期后呈下降趨勢(shì)。下丘腦內(nèi)初情期與初生、180日齡的GPR54 mRNA表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，垂體內(nèi)初情期與初生、60日齡、

10、180日齡的GPR54 mRNA表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，卵巢內(nèi)初情期與初生、60日齡、120日齡、180日齡的GPR54 mRNA表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。(3)下丘腦、垂體與卵巢內(nèi)Ob-Rb mRNA發(fā)育性變化模式與NPY-Y1基本相同，從初生到初情期表達(dá)量逐漸下降，在初情期達(dá)到最低，初情期后呈上升趨勢(shì)。下丘腦內(nèi)120日齡、初情期與180日齡之間Ob-Rb mRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，其

11、它時(shí)期NPY-Y1 mRNA表達(dá)量均顯著差異(P＜0.05)，垂體內(nèi)60日齡與120日齡之間Ob-Rb mRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，其它時(shí)期NPY-Y1 mRNA表達(dá)量均顯著差異(P＜0.05)，卵巢內(nèi)初情期與180日齡之間Ob-Rb mRNA表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，其它時(shí)期Ob-Rb mRNA表達(dá)量均顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果初步顯示了三種受體在豬下丘腦-垂體-卵巢生殖軸中不同發(fā)育時(shí)期的變化，并且證明發(fā)育時(shí)

12、期中NPY對(duì)GnRH釋放起到是抑制作用，而leptin對(duì)GnRH起釋放作用，低劑量的leptin可促進(jìn)GnRH-LH的分泌，高濃度則抑制其分泌，這為以后的研究提供了可靠的科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　 6.采用mRNA差異顯示技術(shù)、Reverse Northern技術(shù)以及半定量分析技術(shù)，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期豬下丘腦差異表達(dá)的ESTs進(jìn)行分離，共得到cDNA差異片斷20條，半定量分析顯示：其中5條差異條帶在出生時(shí)呈表達(dá)增強(qiáng)相，11條差異條帶在初情期時(shí)