轉(zhuǎn)基因BKT和CRTR-B啟動(dòng)蘋果生物合成蝦青的研究.pdf

1、蝦青素(astaxanthin)是一種氧化型酮式紅色類胡蘿卜素，與其前體物質(zhì)β-胡蘿卜素和玉米黃素相比，具有更強(qiáng)的抗光氧化能力。蘋果營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是世界上主要栽培樹種之一。蘋果果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育期間常出現(xiàn)日燒現(xiàn)象，通常蘋果日燒是由于果實(shí)在溫度逆境和強(qiáng)光下發(fā)生的光氧化傷害所致。如果能把蘋果中的β-胡蘿卜素和玉米黃素變成蝦青素，則有可能在一定程度上提高果實(shí)的抗光氧化、抗日燒能力，同時(shí)還可改善果實(shí)色澤，對(duì)于進(jìn)一步提高果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和商品價(jià)

2、值有重要意義。
　　 β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶(CRTR-B)是蝦青素生物合成的關(guān)鍵酶，本研究將bkt基因和crtR-B基因構(gòu)建到載體上獲得植物表達(dá)載體，并通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105獲得工程菌株。以‘Brookfield嘎拉’蘋果葉片為受體，由工程菌介導(dǎo)對(duì)其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，有望通過(guò)調(diào)控代謝途徑，在蘋果中合成蝦青素。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定了蘋果果實(shí)中β-胡

3、蘿卜素的含量。結(jié)果表明，不同品種β-胡蘿卜素含量不同，煙富3中β-胡蘿卜素含量＞皇家嘎啦＞綠色品種塔斯坎;同一品種不同品系也不同，早熟富士紅將軍＞條紅煙富3＞片紅煙富6;果皮中β-胡蘿卜素含量高于果肉;煙富3套袋果β-胡蘿卜素含量顯著低于非套袋果，果皮和果肉中分別降低了30.43％和4.38％。果實(shí)中β-胡蘿卜素含量的測(cè)定為以β-胡蘿卜素為底物合成蝦青素的遺傳轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。
　　 2.構(gòu)建了植物表達(dá)載體p1301-bkt和p1

4、301-bkt-crtR-B。用bkt基因替換pBI221中的GUS基因形成含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的bkt基因表達(dá)盒，然后插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中，獲得植物表達(dá)載體p1301-bkt;再用crtR-B基因替換載體p1301-bkt中的GUS基因，獲得雙價(jià)植物表達(dá)載體p1301-bkt-crtR-B。轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，獲得工程菌EHA105/p1301-bkt和EHA105/p1301-bkt-c

5、rtR-B。
　　 3.研究了影響遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素如激素種類和濃度、抗生素篩選、農(nóng)桿菌侵染等對(duì)‘Brookfield嘎啦’葉片再生的影響，同時(shí)研究了抗生素Km和Hm對(duì)試管苗增殖和生根的影響，為后面工程菌介導(dǎo)的蘋果遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:TDZ誘導(dǎo)葉片再生芽數(shù)顯著高于6-BA，最佳濃度配比為TDZ1.0 mg/L、NAA0.4 mg/L;嘎啦蘋果對(duì)抗生素Km和Hm均很敏感，葉片再生最佳Km和Hm選擇壓為10 mg/L和3 m

6、g/L，試管苗增殖為40 mg/L和4 mg/L，生根為5 mg/L和2 mg/L; Cef濃度小于600 mg/L時(shí)，對(duì)葉片再生芽數(shù)的影響不明顯;農(nóng)桿菌侵染對(duì)葉片傷害較大，與對(duì)照相比顯著降低了葉片再生芽數(shù)。
　　 4.以蘋果無(wú)菌試管苗葉片為受體，以工程菌EHA105/p1301-bkt介導(dǎo)蘋果遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，共獲得9株轉(zhuǎn)化植株(R1-R9)和部分抗性愈傷組織，GUS染色、PCR和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明其中有8株(R1，R2，R3

7、，R4，R6，R7，R8，R9)bkt基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株基因組中并獲得了表達(dá)，表型觀察初步斷定能以玉米黃素為底物合成蝦青素。
　　 5.以工程菌EHA105/p1301-bkt-crtR-B介導(dǎo)蘋果遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，共獲得7株轉(zhuǎn)基因植株和部分抗性愈傷組織，經(jīng)PCR、RT-PCR和Southern blotting檢測(cè)，結(jié)果表明:有4株(G1，G4，G5，G7)bkt和crtR-B基因均整合到蘋果基因組中并在基因組中得到了表達(dá);有1