副豬嗜血桿菌分子流行病學(xué)調(diào)查及其HSP70對(duì)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP3-GP5的免疫協(xié)同作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， H.parasuis）是豬Glasser's病的病原體，豬上呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件下侵入機(jī)體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。目前，我國很多省市患病豬群中均可分離獲得副豬嗜血桿菌，該菌已成為保育豬死亡的主要原因之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但由于不同血清型及同一血清型的不同菌株之間抗原性差異較大，交叉保護(hù)性差；同時(shí)該菌的毒力因子

2、和保護(hù)性抗原尚不清楚，因此，目前尚無有效的預(yù)防和控制措施。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病，又稱“豬藍(lán)耳病”，本病以妊娠母豬的繁殖障礙（后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎）及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病（間質(zhì)性肺炎）為特征。本病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)已成為

3、危害規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)的主要疫病之一。目前，已有商品化的弱毒疫苗和滅活苗用于PRRS的防制，但由于其自身的缺陷而不能提供有效的免疫保護(hù)。近年來，我國大范圍出現(xiàn)高致病性PRRSV感染，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也對(duì)該病的防治帶來新的挑戰(zhàn)。
　　 本研究對(duì)我國6個(gè)省市的副豬嗜血桿菌的分子流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，對(duì)其熱休克蛋白70(Heat shock protein70, HSP70)進(jìn)行了克隆鑒定，并設(shè)計(jì)構(gòu)建了共表達(dá)副豬嗜血桿菌H

4、SP70或其羧基端與PRRSV膜相關(guān)蛋白GP3和GP5的重組腺病毒，通過小鼠免疫試驗(yàn)證明了副豬嗜血桿菌HSP70及其羧基端的免疫增強(qiáng)作用，并通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)了對(duì)高致病性毒株攻毒有一定的免疫保護(hù)效果，為PRRSv基因工程疫苗研究提供了新的思路。
　　 本研究內(nèi)容分為以下6個(gè)部分：
　　 1.副豬嗜血桿菌tbpA基因PCR-RFLP分析
　　 利用針對(duì)H.parasuis轉(zhuǎn)鐵蛋白基因tbpA的PCR-RFLP分型

5、方法，對(duì)2003-2008年分離自江蘇、上海、廣西、浙江、江西和安徽等6省市的57個(gè)H.parasuis分離株及15個(gè)參考菌株進(jìn)行7PCR-RFLP分析，15個(gè)血清型參考菌株分為9種基因型，57個(gè)H.parasuis流行分離株分為15種基因型，其中在我國最為流行的基因型分別為DBN(38％)，ABN(18％)與DBP(12％)。該結(jié)果證明副豬嗜血桿菌在我國豬群中普遍存在，并至少有15個(gè)RFLP基因亞型，從而為我國副豬嗜血桿菌病的防治提供

6、了重要理論依據(jù)。
　　 2.副豬嗜血桿菌熱休克蛋白70基因的測(cè)序、表達(dá)與抗原性鑒定
　　 利用簡(jiǎn)并引物首次從副豬嗜血桿菌基因組DNA中克隆獲得全長HSP70基因(GenBank登錄號(hào)為EU693116)，DNA測(cè)序結(jié)果表明，HSP70完整閱讀框1908bp，根據(jù)編碼序列推導(dǎo)出相應(yīng)635個(gè)氨基酸。經(jīng)BLAST分析表明，其氨基酸序列與溶血性曼氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等同源性最高，達(dá)到90％左右。將HSP70部

7、分基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。SDS-PAGE表明表達(dá)的融合蛋白約46KDa，用豬抗副豬嗜血桿菌血清進(jìn)行Western-blotting，結(jié)果顯示該融合蛋白具有副豬嗜血桿菌抗原性。用鎳柱親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白免疫小鼠，制備抗血清，Western-blot結(jié)果顯示，小鼠抗血清與該融合蛋白有明顯的特異

8、性反應(yīng)條帶，證明該重組蛋白具有良好的抗原性。
　　 3.共表達(dá)H.parasuis HSP70與PRRSV GP3和GP5重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 利用PCR擴(kuò)增出高致病性PRRSV-SY0608分離株的GP3基因，按正確的讀碼框與GP5基因串聯(lián)，成功構(gòu)建穿梭載體pShuttle-CMV-GP3-GP5，經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定正確。然后用兩個(gè)不同linker將副豬嗜血桿菌的HSP70基因按正確的讀碼框克隆入pShuttl

9、e-CMV-GP3-GP5，構(gòu)建另外兩個(gè)穿梭載體pShuttle-CMV-HSP-GP3-GP5及pShuttle-CMV-HSP-2A-GP3-GP5。上述三個(gè)穿梭載體經(jīng)PmeⅠ線性化后在BJ5183大腸桿菌內(nèi)與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒基因組DNA。將重組腺病毒基因組DNA經(jīng)PacⅠ酶切線性化后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，分別在細(xì)胞內(nèi)包裝成完整的腺病毒rAd-GP35、rAd-HS35和rAd-H

10、SA35。上述三個(gè)重組腺病毒的TCIDs0分別為10-10.0/mL、10-10.5/mL和10-10.25/mL。通過RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Western blot可以檢測(cè)到HSP/GP3/GP5蛋白的表達(dá)，證明重組腺病毒可以正確表達(dá)目的蛋白，從而為下一步的免疫試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　 4.共表達(dá)H.parasuis HSP70與PRRSV GP3和GP5重組腺病毒的小鼠免疫特性研究
　　 取75只BA

11、LB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組15只。第1、2組分別注射PBS或wtAd（野生型腺病毒）作為對(duì)照組，第3-5組分別背部皮下免疫重組腺病毒rAd-GP35（融合表達(dá)GP3-GP5蛋白）、rAd-HS35（融合表達(dá)HSP-GP3-GP5蛋白）和rAd-HSA35（共表達(dá)HSP-2A-GP3-GP5融合蛋白），間隔三周用同樣方法加強(qiáng)免疫一次。分別在首次免疫后21d、35d及49d采血測(cè)定ELISA抗體及中和抗體，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PRRSV

12、抗原刺激后測(cè)定其增殖能力及分泌細(xì)胞因子的能力。結(jié)果為：3-5組小鼠在免疫后均可誘導(dǎo)PRRSV特異的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。與免疫rAd-GP35的小鼠相比，免疫rAd-HS35和rAd-HSA35的小鼠產(chǎn)生了更高滴度的中和抗體，二免后6周效價(jià)為1:64，并可產(chǎn)生較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖。同時(shí)，免疫rAd-HS35與rAd-HSA35的小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)體外PRRSV抗原刺激后產(chǎn)生了比rAd-GP35更高水平的IFN-γ(P＜0.05)和IL-4。

13、r>　　 5.共表達(dá)H.parasuisHSP70與PRRSVGP3和GP5重組腺病毒對(duì)仔豬的攻毒保護(hù)研究
　　 取20頭2-3周齡的PRRSV陰性豬，隨機(jī)分為4組，每組5頭，其中三組分別間隔三周免疫兩次重組腺病毒rAd－GP35、rAd-HS35及rAd-HSA35，另外一組按同樣方法免疫野生型腺病毒wtAd作為對(duì)照。在二免后三周用高致病性SY0608株P(guān)RRSV進(jìn)行攻毒，以觀察不同重組腺病毒對(duì)仔豬攻毒的免疫保護(hù)效力。分別在

14、首次免疫后21d、42d、45d、49d和56d采血測(cè)定ELISA抗體、中和抗體、血清中細(xì)胞因子、病毒血癥等。攻毒后每日觀察并記錄臨床癥狀、測(cè)定體溫，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)所有攻讀豬進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。結(jié)果為：免疫rAd-GP35,rAd-HS35及rAd-HSA35的豬產(chǎn)生了PRRSV特異性的體液免疫應(yīng)答，且rAd-HSA35誘導(dǎo)的中和抗體滴度明顯高于rAd-GP35免疫組，差異顯著(P＜0.05)。同時(shí)，rAd-HS35及rAd-HSA3

15、5免疫仔豬血清中的IFN-γ(P＜0.05)及IL-4的含量也明顯升高。攻毒后，與wtAd和rAd-GP35免疫組相比，rAd-HS35及rAd-HSA35免疫仔豬的臨床癥狀較輕，病毒血癥較低，肺部病理變化也較輕。此外，rAd-HSA35誘導(dǎo)的保護(hù)效力明顯高于rAd-HS35。
　　 6.共表達(dá)H.parasuis HSP70羧基端與PRRSV GP3和GP5重組腺病毒的構(gòu)建與小鼠免疫特性研究
　　 本研究利用PCR擴(kuò)增

16、出副豬嗜血桿菌的HSP70羧基端(384-635aa)基因tHSP70，然后用兩個(gè)不同linker將副豬嗜血桿菌的tHSP70基因按正確的讀碼框克隆入重組穿梭載體pShuttle-CMV-GP3-GP5，構(gòu)建另兩個(gè)穿梭載體pShuttle-CMV-tHSP-GP3-GP5及pShuttle-CMV-tHSP-2A-GP3-GP5，按上述方法，構(gòu)建了兩個(gè)含tHSP70的重組腺病毒rAd-tHS35及rAd-tHSA35。RT-PCR、IF

17、A和Western blot結(jié)果證明，該重組腺病毒可以正確表達(dá)tHSP/GP3/GP5蛋白，兩個(gè)重組腺病毒病毒滴度均為10-12.0/mL。為進(jìn)一步研究其免疫特性，取105只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為7組，每組15只。第1、2組分別注射PBS或wtAd作為對(duì)照組，第3-7組分別背部皮下免疫重組腺病毒rAd-GP35（融合表達(dá)GP3-GP5蛋白）、rAd-HS35（融合表達(dá)HSP-GP3-GP5蛋白）、rAd-HSA35（共表達(dá)HSP-2

18、A-GP3-GP5融合蛋白）、rAd-tHS35（融合表達(dá)tHSP-GP3-GP5蛋白）和rAd-tHSA35（共表達(dá)tHSP-2A-GP3-GP5融合蛋白），間隔三周用同樣方法加強(qiáng)免疫一次。結(jié)果為：第3-7組免疫后均可產(chǎn)生PRRSV特異的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。rAd-HS35、rAd-HSA35、rAd-tHS35和rAd-tHSA35免疫組中和抗體水平、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、以及IFN-γ水平均顯著高于rAd-GP35免疫組(P＜0.05