烯酰嗎啉對(duì)荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)的生物活性及其抗性研究.pdf

1、荔枝霜疫霉病是我國(guó)荔枝上最嚴(yán)重的卵菌病害，常常造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。除了利用抗病品種和加強(qiáng)栽培管理以外，化學(xué)藥劑是防治該病害最為有效的措施。烯酰嗎啉是一種羧酸酰胺類(CAA)化學(xué)殺菌劑，它對(duì)霜霉屬和疫霉屬的真菌有很強(qiáng)的活性，在全球范圍內(nèi)被用來防治多種霜霉和疫霉病害。除游動(dòng)孢子形成及孢子游動(dòng)期外，對(duì)卵菌生活史的各個(gè)階段均有作用。該藥劑內(nèi)吸性強(qiáng)，對(duì)植株具有很好的保護(hù)、治療活性，也具有良好的持效期，于上世紀(jì)90年代中期開始用于中國(guó)黃瓜霜霉病和荔

2、枝霜疫霉病的防治。目前，它對(duì)荔枝霜疫霉的研究還是空白。本文以傳統(tǒng)和新型的殺卵菌劑為對(duì)照藥劑，系統(tǒng)研究了烯酰嗎啉對(duì)荔枝霜疫霉病菌室內(nèi)、外的生物活性;建立了該藥劑對(duì)該病菌的敏感性基線，并根據(jù)基線系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)了2007-2008年荔枝霜疫霉病原菌群體對(duì)烯酰嗎啉的敏感性;室內(nèi)誘導(dǎo)了荔枝霜疫霉病菌羧酸酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉的抗藥性突變體，并對(duì)其生物學(xué)習(xí)性進(jìn)行了研究;克隆了敏感和抗性菌株的膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，并進(jìn)行了基因序列的比對(duì)分析，以探究烯酰嗎啉的

3、抗藥性機(jī)理。
　　 由荔枝霜疫霉病菌引起的荔枝霜疫霉病是我國(guó)荔枝上具有嚴(yán)重破壞性重要的病害之一。本文首先詳細(xì)地研究了烯酰嗎啉、嘧菌酯、惡唑菌酮、甲霜靈、霜脲氰及代森錳鋅6種不同類型的殺菌劑對(duì)荔枝霜疫霉病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子囊產(chǎn)量、游動(dòng)孢子的釋放、孢子囊的直接萌發(fā)及休止孢的萌發(fā)的生物活性。結(jié)果表明烯酰嗎啉和甲霜靈對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，其次為代森錳鋅，嘧菌酯、惡唑菌酮和霜脲氰的活性最低;烯酰嗎啉和甲霜靈對(duì)孢子囊的形成也具有很高的

4、活性，其抑制作用顯著高于其它類藥劑;游動(dòng)孢子的釋放對(duì)嘧菌酯和惡唑菌酮最為敏感，其次為代森錳鋅，而烯酰嗎啉、甲霜靈和霜脲氰對(duì)其沒有抑制作用;孢子囊的直接萌發(fā)對(duì)嘧菌酯和惡唑菌酮最為敏感，其次為烯酰嗎啉和代森錳鋅，而甲霜靈和霜脲氰對(duì)此階段沒有活性;休止孢的萌發(fā)對(duì)嘧菌酯和惡唑菌酮也最為敏感，其次為烯酰嗎啉，代森錳鋅的活性稍低，而甲霜靈和霜脲氰均不影響其萌發(fā)。首次對(duì)荔枝霜疫霉不同無性階段的生物活性進(jìn)行了研究，為荔枝霜霉病的化學(xué)防治提供了理論基礎(chǔ)。

5、
　　 其次，本文以荔枝果實(shí)和葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，以常用的代森錳鋅、霜脲氰和甲霜靈為對(duì)照藥劑，研究了新型殺卵菌劑烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、氟嗎啉、丁吡嗎啉、嘧菌酯和惡唑菌酮對(duì)荔枝霜疫霉病活體上的生物活性。結(jié)果表明該病原菌在荔枝果實(shí)上的致病力顯著強(qiáng)于葉片上，而選擇成熟的果實(shí)進(jìn)行活性測(cè)定。接菌前24 h用藥劑處理，所有藥劑對(duì)該病害在果實(shí)上的抑制作用都隨著藥劑濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、氟嗎啉和甲霜靈的抑制作用最強(qiáng)，其EC5

6、0和EC90值分別為1.04、2.91、2.67、2.46 mg L-1，和5.0、8.63、8.58、6.72 mg L-1;其次為甲氧基丙烯酸酯類的嘧菌酯和惡唑菌酮，及霜脲氰，其EC50值的范圍為19.48-31.84 mg L-1;效果最差的為丁吡嗎啉和代森錳鋅，其EC50值分別為125.8和＞800 mg L-1。雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、氟嗎啉和甲霜靈在25 mg L-1時(shí)均可以完全抑制荔枝霜疫霉病菌的侵染，然而其它藥劑在最高劑量

7、200 mg L-1時(shí)卻不能完全抑制該病的擴(kuò)展。
　　 本文進(jìn)一步研究了四株荔枝霜疫霉菌株在不同無性階段對(duì)四種羧酸類殺菌劑（烯酰嗎啉、氟嗎啉、丁吡嗎啉、雙炔酰菌胺）的敏感性。結(jié)果表明四種藥劑都不影響霜疫霉游動(dòng)孢子的釋放;但都強(qiáng)烈的抑制菌絲的生長(zhǎng)、孢子囊的產(chǎn)量、休止孢和孢子囊的萌發(fā)。四種藥劑對(duì)各個(gè)階段的平均抑制中濃度(EC50值)分別為0.075、0.258、0.115、0.0048 mg L-1,0.085、0.315、0.15

8、0、0.0032 mg L-1,0.140、0.150、0.645、0.0023 mgL-1，0.203、0.5、0.743、0.0061 mg L-1。同其它無性階段相比，菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉和丁吡嗎啉最為敏感，因此菌絲生長(zhǎng)速率法作為敏感性基線的研究方法。2007年從中國(guó)福建、廣東和廣西三省共采集131株荔枝霜疫霉菌株，其中127、116、113和100株分別用來建立荔枝霜疫霉對(duì)烯酰嗎啉、氟嗎啉、丁吡嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性基線。結(jié)果表

9、明不同省的菌株對(duì)四種藥劑具有相似的敏感性;荔枝霜疫霉對(duì)烯酰嗎啉、氟嗎啉、丁吡嗎啉和雙炔酰菌胺的敏感性均成單峰曲線，其平均EC50值分別為0.082(±0.01)、0.282(±0.047)、0.115(±0.032)和0.0055(±0.0012) mg L-1。本結(jié)論將對(duì)以后荔枝霜疫霉病對(duì)這四種羧酸類殺菌劑的敏感性變化研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 LBA平板上菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)得荔枝霜疫霉病菌對(duì)烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性基線的平均值分

10、別為0.082(±0.01)，0.081(±0.045) mg L-1，本文以此基礎(chǔ)監(jiān)測(cè)了2007-2008年我國(guó)南方主要荔枝產(chǎn)區(qū)荔枝霜疫霉病菌對(duì)烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性。分別于2007和2008年從廣西、廣東、福建、及海南4省共采集分離得到118和397株菌株。以0.25 mg L-1烯酰嗎啉和1 mgL-1甲霜靈作為區(qū)分劑量，對(duì)所采集菌株進(jìn)行抗藥性監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明，兩年所采集的515株荔枝霜疫霉菌株均對(duì)這兩種藥劑均為敏感，沒有檢測(cè)到任

11、何抗藥性菌株。因此，烯酰嗎啉和甲霜靈在我國(guó)荔枝上使用10多年后，仍可作為荔枝霜疫霉病的主要防治藥劑。
　　 通過對(duì)荔枝霜疫霉菌在室內(nèi)含藥平板上兩步藥劑馴服，獲得了四株羧酸酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉抗藥性突變體。其中，第一步誘得兩株抗性穩(wěn)定的菌株，抗性倍數(shù)分別為14.65和2158，誘導(dǎo)率為0.926％;第二步馴服是將第一步獲得低抗菌株繼續(xù)在20 mgL-1烯酰嗎啉馴服，得兩株抗性倍數(shù)分別為141.09和24.4的菌株，誘導(dǎo)率為1％。室

12、內(nèi)毒力測(cè)定表明四突變體均降低了對(duì)CAA類殺菌劑的敏感性。烯酰嗎啉同雙炔酰菌胺、氟嗎啉及丁吡嗎啉間存在正交互抗性，且除雙炔酰菌胺外的其余三藥劑交互抗性倍數(shù)基本一致;而與甲氧基丙烯酸酯類嘧菌酯和惡唑菌酮、苯基酰胺類甲霜靈、乙酰胺類霜脲氰、及保護(hù)性的代森錳鋅間均不存在交互抗性。適合度研究表明抗藥性突變體具有同敏感菌株同樣的溫度適應(yīng)能力;其游動(dòng)孢子形成的能力變?nèi)?休止孢萌發(fā)和孢子囊的直接萌發(fā)能力同敏感菌株一樣或稍微有所降低;部分突變體菌絲生長(zhǎng)速

13、度增強(qiáng)而產(chǎn)孢量（離體和活體上）和致病力均減弱，部分突變體的產(chǎn)孢能力（離體和活體上）不變而菌絲生長(zhǎng)速度和致病力均減弱;在無藥平板上連續(xù)培養(yǎng)11代后，第一步誘得的2抗性菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性穩(wěn)定，第二步誘得的突變體敏感性增強(qiáng)。本研究表明荔枝霜疫霉對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)水平較低，也是荔枝霜疫霉病菌不同抗藥性水平的首次報(bào)道。
　　 據(jù)報(bào)道羧酸酰胺類殺菌劑通過作用于膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶來抑制卵磷脂的生物合成。本文最后克隆了荔枝霜疫霉病菌羧