庫爾勒香梨莖尖蘋果褪綠葉斑病毒原位RT-PCR檢測技術研究.pdf

1、原位逆轉(zhuǎn)錄PCR是一種特異、敏感的分子生物學—細胞學方法，結(jié)合了PCR和原位雜交的優(yōu)點，既可檢測出樣品中低拷貝的核酸，又可確定其細胞來源和在細胞中的位置。開展該研究，可通過觀察擴增的cDNA在組織中的分布，進行病毒感染分析。這樣既可為果樹病毒檢測提供一種新的途徑，又可為研究病毒在組織中的生成、分布和轉(zhuǎn)移途徑提供幫助，也為果樹無毒化生產(chǎn)提供—理論依據(jù)。因而具有重要的理論價值和生產(chǎn)實踐意義。 本試驗以已知帶有蘋果褪綠葉斑病毒的香梨和

2、杜梨實生苗的莖尖為材料，用Dig-11-duTP對擴增產(chǎn)物進行標記。研究了香梨莖尖石蠟切片IS-RT-PCR及原位雜交檢測技術。 本研究的主要內(nèi)容包括： 1.系統(tǒng)研究了石蠟切片方法對原位RT-PCR及原位雜交切片質(zhì)量的影響。結(jié)果表明：組織經(jīng)4％多聚甲醛固定1h；50％、70％、85％、95％、100％乙醇脫水各1h；1/2二甲苯和1/2乙醇處理1h一次、二甲苯處理1h一次；浸蠟低溫38℃過夜處理；高溫58℃2h一次共3次

3、；切片厚度為7-8μm；并用酒精-水浴法展片。適合于以莖尖為材料的原位RT-PCR及原位雜交。 2.用PCR法制作出了適合原位雜交的地高辛標記的cDNA探針。 3.應用了一步RT-PCR反應，簡化了試驗步驟，縮短了試驗周期。 4.確定了梨樹蘋果褪綠葉斑病毒在莖尖中的分布位置。試驗中設置了多種陰性對照，結(jié)果表現(xiàn)為：陰性對照組織中均未顯現(xiàn)藍紫色。而陽性材料組織的一些細胞表現(xiàn)出明顯的藍紫色，說明梨樹蘋果褪綠葉斑病毒在莖