玉米彎孢霉葉斑病菌突變株致病相關(guān)性狀分析與基因克隆.pdf

1、玉米彎孢霉葉斑病是由新月彎孢霉( Curvularia lunata (Wakker) Boed)引起的一種重要玉米病害。盡管近年來(lái)由于抗性品種推廣,病害得到一定控制,但由于該病原菌存在明顯生理分化現(xiàn)象,且我國(guó)玉米種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄,抗性資源趨同化嚴(yán)重,該病害再次爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)性較大。目前關(guān)于該菌致病分子機(jī)理研究報(bào)道少且不深入,這直接影響了對(duì)該病害有針對(duì)性的綜合防治。為此本研究通過(guò)ATMT(Agrobacterium-mediated t

2、ransformation)方法構(gòu)建玉米彎孢霉葉斑病菌突變株,分析突變株致病性相關(guān)生物學(xué)性狀,克隆致病相關(guān)基因。
　　1、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT),以野生強(qiáng)致病型菌株CX3為出發(fā)菌,構(gòu)建玉米彎孢霉葉斑病菌轉(zhuǎn)化子。首先研究了彎孢霉葉斑病菌分生孢子萌發(fā)時(shí)間、農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)時(shí)間與溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響,從而優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件,使轉(zhuǎn)化效率提升至84±5個(gè)/106個(gè)分生孢子,共獲得ATMT突變株1,454個(gè)。
　　2、從

3、大量突變株中篩選到9個(gè)在菌落形態(tài)顏色、生長(zhǎng)速度等性狀上有顯著變化的突變株,分別測(cè)定其產(chǎn)孢量、細(xì)胞壁降解酶活性、毒素、致病相關(guān)基因表達(dá)量等指標(biāo),并通過(guò)離體和活體接種確定突變株致病性,獲得弱致病性突變株5個(gè),為研究致病相關(guān)基因提供了良好材料。
　　3、通過(guò)PCR、Southern blot確定突變株CLM-1648為T(mén)-DNA單拷貝插入。利用Genome Walking、RT-PCR技術(shù),并結(jié)合生物信息學(xué),克隆了T-DNA插入位點(diǎn)的基

4、因。經(jīng)過(guò)BLAST分析,該基因與小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophora tritici-repentis) ATP-phosphoribosyl transferase基因序列有78％的相似性。該基因全長(zhǎng)1,175 bp,含有兩個(gè)內(nèi)含子,cDNA全長(zhǎng)1,038 bp,在彎孢霉葉斑病菌基因組中為單拷貝。RT-PCR分析表明T-DNA插入影響了該基因在菌體內(nèi)的表達(dá)量。推測(cè)該基因通過(guò)調(diào)控組氨酸代謝或其它致病相關(guān)生理過(guò)程影響病菌的致病性。

5、r>　　4、對(duì)突變株CLM-1648的生物學(xué)性狀觀察顯示,該突變株菌落顏色淺、產(chǎn)孢量增加、分生孢子萌發(fā)速度快,但與野生型菌株CX3相比,對(duì)洋蔥表皮侵染能力和對(duì)感病玉米植株的致病性明顯下降,其病情指數(shù)下降70%左右。突變株在基本培養(yǎng)基(MM)很難形成或僅能形成極少量分生孢子,說(shuō)明該突變株無(wú)性繁殖能力、營(yíng)養(yǎng)利用能力和對(duì)營(yíng)養(yǎng)的選擇性均發(fā)生明顯變化,推測(cè)這些變化與致病性減弱有關(guān)。所克隆基因的功能需通過(guò)基因敲除進(jìn)行驗(yàn)證。已經(jīng)以質(zhì)粒pV2為基礎(chǔ)構(gòu)建