滸苔多糖對(duì)膿毒癥腦病大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥相關(guān)性腦?。⊿epsis-associated encephalopathy，SAE）是膿毒癥患者常見的彌漫性腦功能障礙，與膿毒癥患者的死亡率密切相關(guān)。SAE引起的認(rèn)知功能障礙是主要的神經(jīng)損傷之一，與癥狀的嚴(yán)重程度并無相關(guān)性，但對(duì)患者遠(yuǎn)期的生活質(zhì)量影響較大。因此，迫切需要探索SAE的發(fā)病機(jī)制，并開發(fā)相應(yīng)的藥物以減輕SAE的嚴(yán)重程度，最終降低SAE的死亡率。
　　氧化應(yīng)激與SAE的發(fā)病密切相關(guān)。過多的氧自由基和/或抗氧化劑缺乏

2、對(duì)大腦的不同區(qū)域造成明顯的形態(tài)和認(rèn)知功能障礙，而通過藥物抑制氧化應(yīng)激確實(shí)可以逆轉(zhuǎn)膿毒癥相關(guān)性腦病大鼠出現(xiàn)的認(rèn)知能力下降。此外，高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）也可以促進(jìn)SAE的發(fā)生。
　　腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一員，廣泛分布在大腦中。BDNF在神經(jīng)元存活和突觸傳遞中

3、發(fā)揮重要作用。在SAE大鼠模型中，丙戊酸通過激活BDNF可以顯著改善SAE大鼠認(rèn)知功能障礙，提示BDNF可以作為緩解SAE的有用治療靶標(biāo)。
　　滸苔多糖（Enteromorpha clathrate polysaccharides，ECP）是從滸苔中純化的多糖成分，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用。滸苔多糖可顯著降低膿毒癥大鼠中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量，從而減輕炎癥反應(yīng)；提高淋巴細(xì)胞數(shù)和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，從而改善免疫功能。然而，滸

4、苔多糖是否能夠改善膿毒癥大鼠的認(rèn)知表現(xiàn)仍然難以捉摸。因此，本研究旨在探討滸苔多糖對(duì)SAE的腦保護(hù)作用，并找出潛在的機(jī)制。
　　目的：本研究旨在觀察滸苔多糖腹腔注射對(duì)膿毒癥大鼠認(rèn)知功能的影響，并探索其腦保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）分組及建立模型
　　將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（CON組）、SAE組、SAE+滸苔多糖組（SAE+ECP組），每組20只，SAE+滸苔多糖組腹腔內(nèi)注

5、射100 mg/kg滸苔多糖，CON組和SAE組于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔內(nèi)注射生理鹽水。
　　選用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）建立SAE模型。取SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，腹部剃毛并用碘伏消毒，沿腹中線剪開2 cm腹部切口，暴露盲腸，在回盲瓣遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸，然后用針刺穿刺盲腸2次，輕輕擠壓盲腸，使少量的腸內(nèi)容物滲出，然后將盲腸返回到腹腔，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組大鼠行剖腹，并將盲腸外置1分鐘，不予盲腸穿刺或結(jié)扎

6、，然后將盲腸放回腹腔并關(guān)腹。每只手術(shù)操作的大鼠術(shù)后每6小時(shí)給予皮下注射生理鹽水（30 mL/kg）及頭孢曲松（30 mg/kg）。制作膿毒癥大鼠模型24小時(shí)后評(píng)估大鼠神經(jīng)行為學(xué)，計(jì)算神經(jīng)反射評(píng)分≤6分的為SAE模型。不符合SAE模型標(biāo)準(zhǔn)的，則放棄該例大鼠并重新制作大鼠膿毒癥模型補(bǔ)充。
　?。?）大鼠一般狀況
　　觀察各組大鼠的精神狀況，有無立毛、寒戰(zhàn)、腹瀉和出血傾向，測(cè)量術(shù)前、術(shù)后6 h、12 h和24 h大鼠的體溫、心率和

7、平均動(dòng)脈壓等基本生命體征，并測(cè)量實(shí)驗(yàn)大鼠7d的體重變化。
　?。?）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及Y-迷宮測(cè)試評(píng)估各組大鼠的一般活動(dòng)能力和學(xué)習(xí)記憶能力。
　?。?）氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)
　　采用硝酸還原酶法測(cè)定各組大鼠海馬 NO含量；采用 L-精氨酸氧化法測(cè)定各組大鼠海馬iNOS含量；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定各組大鼠海馬丙二醛（MDA）活性；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定各組大鼠海馬超氧化物歧化酶（SO

8、D）活性；此外，還檢測(cè)了大鼠海馬組織過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性。
　?。?）BDNF/p-TrkB的表達(dá)
　　處死大鼠，取大鼠海馬組織，用Western blot法分別檢測(cè)BDNF和p-TrkB的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（1）動(dòng)物一般狀況
　　對(duì)照組大鼠一般狀況良好，心率、呼吸頻率和體溫等基本生命體征平穩(wěn)；SAE組大鼠表現(xiàn)出蜷縮少動(dòng)、豎毛，個(gè)別大鼠出現(xiàn)偏癱、癲癇發(fā)作；而且

9、平均動(dòng)脈壓和體重明顯下降，心率顯著升高。
　?。?）行為學(xué)試驗(yàn)
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，各組大鼠的探索路程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明假手術(shù)、SAE或ECP不影響大鼠的自主活動(dòng)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，CON組和SAE+ECP組大鼠到達(dá)目標(biāo)平臺(tái)的時(shí)間明顯少于SAE組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SAE組大鼠的游泳距離較CON組和SAE+ECP組存在顯著差異（P＜0.01），但游泳速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05

10、）；CON組和SAE+ECP組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間比例均明顯高于SAE組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在Y-迷宮測(cè)試中，與CON組和SAE+ECP組相比，SAE組大鼠達(dá)標(biāo)所需的訓(xùn)練次數(shù)較多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果均提示SAE導(dǎo)致明顯的學(xué)習(xí)記憶損害，而滸苔多糖治療能明顯改善SAE大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。
　?。?）各組大鼠海馬氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　各組大鼠的血氨濃度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

11、（P＞0.05），說明滸苔多糖在此實(shí)驗(yàn)中沒有引起血清氨濃度改變從而影響認(rèn)知功能；
　　NO含量變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組NO含量顯著升高；與SAE組相比較，SAE+ECP組NO含量顯著降低（P＜0.01）；
　　iNOS活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組iNOS活力顯著升高（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組iNOS活性顯著降低（P＜0.01）；
　　MDA含量變

12、化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組MDA含量顯著降低（P＜0.01）；
　　CAT活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組CAT活性顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組CAT活性顯著升高（P＜0.01）；
　　SOD活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與SA

13、E組相比較，SAE+ECP組SOD活性顯著升高（P＜0.01）；
　　GSH-Px活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組GSH-Px活性顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.01）；
　　這些結(jié)果均表明，SAE組大鼠海馬區(qū)存在明顯的氧化應(yīng)激損傷，滸苔多糖治療后這些損傷可得到明顯改善。
　　（4）各組大鼠海馬組織中BDNF和p-TrkB表達(dá)水平

14、　　與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組BDNF表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組BDNF表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；
　　與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組p-TrkB表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組p-TrkB表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；
　　結(jié)果表明，SAE引起大鼠海馬組織中BDNF和p-TrkB蛋白表達(dá)下調(diào)，滸苔多糖處理可

15、促進(jìn)BDNF和p-TrkB的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　?。?）CLP組大鼠完全模擬了膿毒癥典型臨床表現(xiàn)，應(yīng)用神經(jīng)行為學(xué)檢查提示大鼠膿毒癥相關(guān)性腦病（SAE）模型制作成功，為后續(xù)SAE機(jī)制研究做好基礎(chǔ)。滸苔多糖能保護(hù)SAE大鼠認(rèn)知記憶功能。
　　（2）膿毒癥可引起大鼠海馬組織氧化應(yīng)激損傷，而滸苔多糖的使用可顯著降低氧化應(yīng)激的水平，表明滸苔多糖可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮其功效。
　?。?）膿毒癥相關(guān)性腦病可導(dǎo)致SAE大