雞胚性分化早期性別差異表達(dá)miRNAs的鑒定及其特性分析.pdf

1、miRNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)基因表達(dá)的小分子非編碼RNA家族。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但它在雞胚性腺分化中的調(diào)控作用還未確定。為研究miRNA在雞胚早期性分化過(guò)程中的表達(dá)，探討miRNA在性腺早期發(fā)育中的作用，本研究以前期芯片篩選出的差異表達(dá)miRNAs為研究對(duì)象，對(duì)其中新的miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并分析了候選miRNAs在雌、雄雞胚早期性腺中的時(shí)空表達(dá)模式。本研究所取得的結(jié)果如下：

2、
　　 1.利用雞基因組信息對(duì)新miRNAs進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)miR-363和363*、miR-551b和miR-612分別位于雞染色體4(-)、9(-)和Z(-)上，同時(shí)通過(guò)克隆獲得了miR-363*在雞基因組上的未知側(cè)翼序列。前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的雞新miRNAs均具有莖環(huán)狀前體結(jié)構(gòu)，成熟序列基本位于相應(yīng)的莖部，且折疊最低自由能均≤-25kcal/mol。miR-363(363*)和miR-551b在人、大鼠、小鼠和

3、雞4個(gè)物種中的同源性分析結(jié)果表明，前體序列的相似性均在80％以上，且成熟序列中僅有個(gè)別堿基的差異。
　　 2.利用RNA加尾及引物延伸和莖環(huán)狀引物的半定量RT-PCR方法分析了13個(gè)miRNAs在E3.5～6.5 d雌、雄雞胚性腺中的時(shí)間表達(dá)譜，并對(duì)它們?cè)谕粫r(shí)期不同性別中以及同一性別不同時(shí)期中的差異性進(jìn)行了顯著性分析。結(jié)果表明，從總體趨勢(shì)看，所檢測(cè)miRNAs中有5個(gè)呈雌性高表達(dá)和4個(gè)呈雄性高表達(dá)，其余4個(gè)為不規(guī)則表達(dá)；miR

4、-363、miR-200b、miR-1810、miR-1599、miR-551b和miR-196在所檢某些時(shí)期兩性間的差異表達(dá)達(dá)到顯著或極顯著水平；miR-363、miR-1456、 miR-196、miR-363*、miR-612、miR-1599、miR-126和miR-1810在同一性別某些時(shí)期間的表達(dá)存在顯著或極顯著差異。
　　 3.利用WISH技術(shù)對(duì)miR-363和miR-1810進(jìn)行空間表達(dá)模式分析，結(jié)果表明，miR

5、-363主要在E4.5d雞胚的四肢、外胚層、脊索以及腦等部位表達(dá)，在E6.5d性腺部位的表達(dá)明顯高于腎臟，且在雌性性腺中的表達(dá)高于雄性；miR-1810主要在E4.5d雞胚的腦和四肢表達(dá)，在E6.5及E8.5d性腺中表達(dá)高于腎臟，且雄性性腺中的表達(dá)高于雌性。
　　 結(jié)合本研究結(jié)果及其它物種中相應(yīng)miRNA的研究，篩選了5個(gè)(miR-363、miR-551b、miR-1810、miR-1599和miR-200b)可能參與早期雞胚性