豚鼠抑制素基因免疫及子宮LHR mRNA表達的研究.pdf

1、豚鼠是不同于大鼠,小鼠的實驗動物,它具有相對較長的發(fā)情周期(16～19d)、較長的妊娠期(68 d左右)和較少的排卵數(shù)(平均3.8個),是研究動物繁殖性狀理想而珍貴的模型。本文應(yīng)用基因克隆、免疫中和、RT-PCR等技術(shù)研究抑制素基因免疫對豚鼠卵泡發(fā)育的影響及豚鼠子宮LHR mRNA的表達差異。
　　 1.抑制素基因免疫對豚鼠抗體產(chǎn)生及卵巢的局部作用
　　 為研究抑制素基因免疫對豚鼠卵泡發(fā)育的影響,以含雙拷貝抑制素(INH

2、α(1～32))片段的基因疫苗pCISI對其進行免疫。將19只性成熟前的雌性豚鼠分為兩組,實驗組(n=15)于股四頭肌三點注射pCISI質(zhì)粒200μg/500μl,對照組(n=4)注射相同體積的生理鹽水。免疫前24 h于相同部位注射0.5％鹽酸普魯卡因100μl。間隔20 d進行加強免疫,免疫劑量為100μg/500μl,共加強免疫4次,末次免疫后發(fā)情周期的第8 d乙醚麻醉后處死豚鼠,收集血樣,采集卵巢及子宮稱重。免疫期間,每隔10 d

3、采集血樣,ELISA檢測抗抑制素抗體水平。卵巢組織連續(xù)切片,HE染色統(tǒng)計各級卵泡數(shù)及黃體數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pCISI免疫誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生了抗抑制素抗體,加強免疫后提高了個體陽性率,但抗體水平并沒有隨免疫次數(shù)的增加而顯著升高(P>0.05)。第二次免疫后實驗組的抗抑制素抗體水平為1.90±0.14,而對照組為1.45±0.09；第三次免疫后實驗組為1.56±0.17,而對照組為1.56±0.06；第五次免疫后的實驗組為0.93±0.64,而對照組

4、為0.30±0.40。卵巢各級卵泡數(shù)及黃體數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果表明,pCISI免疫對卵泡發(fā)育無顯著影響(P>0.05),未能引起性成熟前的豚鼠超數(shù)排卵。
　　 2.豚鼠子宮LHR mRNA表達的研究
　　 在豚鼠發(fā)情周期第0(排卵當天記為0 d即Day0)、4(Day4)、8(Day8)、12 d(Day12)及pCISI免疫后第8 d(Day8(Imu))將其麻醉處死(n=3)。以子宮組織總RNA為模板,參照豬、大鼠及小鼠LH

5、R mRNA保守序列區(qū)設(shè)計引物,用反轉(zhuǎn)錄PCR方法擴增黃體生成素受體(IMR)基因,以PMD19-T vector為載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α,篩選陽性克隆并測序,用BLAST及DNAman軟件分析比對同源性。采用優(yōu)化的半定量RT-PCR技術(shù),以豚鼠的β-actin為分子內(nèi)參,比較研究在發(fā)情周期不同階段、抑制素基因免疫前后的豚鼠子宮組織中LHR mRNA表達量的差異。測序結(jié)果得到686 bp的剪接變異體1和缺失75 bp4

6、號外顯子的剪接變異體2。686 bp序列與人類LHR mRNA序列同源性為83.8％,與牛、豬及綿羊LHR mRNA序列同源性分別為84.6％、84.2％及83.6％,而與大鼠和小鼠LHR mRNA序列同源性則分別高達93.7％和99.4％。LHR mRNA在豚鼠整個發(fā)情周期的子宮中均有表達,發(fā)情周期第0 d的表達水平為0.635±0.0194,第4 d為0.617±0.099,均顯著低于第8 d的表達水平(P<0.05),在第12 d