海綿共附生微生物抗硅藻附著活性篩選及其活性產(chǎn)物研究.pdf

1、海洋生物污損是全球范圍內(nèi)的普遍現(xiàn)象，現(xiàn)行的抗污損毒性化合物，已經(jīng)對海洋環(huán)境和人類健康造成嚴重危害。天然無毒的抗污損化合物的開發(fā)是解決這一環(huán)境難題的主要途徑。海洋自身特殊的生態(tài)環(huán)境，使得生活其中的微生物代謝產(chǎn)物與陸源微生物不同，化合物結(jié)構(gòu)獨特，生物活性多樣。海綿由于其獨特的化學(xué)防御機制，其共附生微生物的多樣性高，可產(chǎn)生具有顯著抗污損活性的次生代謝產(chǎn)物，成為抗污損活性天然產(chǎn)物的重要潛在來源。
　　本文從美國華盛頓州圣璜島海域的8種海綿

2、樣品分離的120株共附生微生物中，篩選出了11株細菌，其粗提物能有效抑制硅藻附著。對其中兩株活性菌株No.683和No.333進行了菌種鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化，并對菌株No.683的活性產(chǎn)物進行分離鑒定，為尋找抑制硅藻附著的活性海綿共附生微生物提供依據(jù)。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用顯微計數(shù)法對120株海綿共附生微生物進行了抗硅藻附著活性的篩選，結(jié)果顯示，11株菌有較好的活性，占總測試菌株的9.2％。在測試濃度為100μg/m

3、L時，對5種測試硅藻的抑制率均大于90.0％。在所有活性菌株中，菌株No.683的效果最好，平均抑制率高達98.0％;No.333次之，平均抑制率為96.3％，而且此2株菌的抑制活性非常穩(wěn)定。
　　2.對菌株No.683和No.333進行形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，結(jié)果表明，菌株No.683與Bacillus pumilus JQ428828同源性達99％，菌株No.333與Bacillus pumilusGU191914

4、同源性達74％。因此鑒定菌株No.683和No.333均為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus。
　　3.通過正交試驗，優(yōu)化了菌株No.683培養(yǎng)基條件。對菌株No.683設(shè)計了四因素三水平正交試驗，發(fā)現(xiàn)蛋白胨濃度、NaCl濃度、pH、發(fā)酵溫度這四種因素對抗硅藻附著活性的影響都是極顯著的，影響的顯著性次序為:蛋白胨濃度＞NaCl濃度＞pH＞發(fā)酵溫度。確定了菌株No.683最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度25℃，pH7.5，NaCl濃

5、度19.45g/L，蛋白胨濃度5g/L。
　　4.通過正交試驗，優(yōu)化了菌株No.333培養(yǎng)基條件。對菌株No.333的培養(yǎng)基設(shè)計了四因素三水平正交試驗，發(fā)現(xiàn)蛋白胨濃度、NaCl濃度、pH、發(fā)酵溫度這四種因素對抗硅藻附著活性的影響都是極顯著的，影響的顯著性次序為:蛋白胨濃度＞ pH＞NaCl濃度＞發(fā)酵溫度。確定了菌株No.333最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度25℃，pH9.5，NaCl濃度24.45 g/L，蛋白胨濃度79/L。
　

6、　5.采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對菌株No.683進行規(guī)模化培養(yǎng)，培養(yǎng)總體積為100 L，經(jīng)乙酸乙酯-丙酮萃取后，得到粗提物9.9 g。菌株No.683發(fā)酵產(chǎn)物的分離過程為:1）初步分離:將粗提物初步分成極性不同的三相:正己烷相、二氯甲烷相和65％甲醇水相，運用顯微計數(shù)法進行活性測試。結(jié)果顯示，活性組分主要集中于二氯甲烷相中。2）硅膠柱色譜分離溶劑體系的選擇:采用薄層層析法選擇分離No.683菌活性產(chǎn)物的溶劑體系、溶劑比例及代謝物質(zhì)的極性范圍

7、。結(jié)果表明，二氯甲烷和甲醇體系適于No.683二氯甲烷相的分離。3)硅膠柱色譜分離:分離條件為二氯甲烷:甲醇，分別為純二氯甲烷、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、純甲醇。對柱分離產(chǎn)物進行活性追蹤，結(jié)果表明40∶1時洗脫下的物質(zhì)具有最強的抗硅藻附著活性。4）反向減壓柱色譜分離:分離條件分別為10％、30％、45％、60％、80％、95％和100％甲醇水，對洗脫下的物質(zhì)進行活性追蹤，結(jié)果顯示95％甲

8、醇水洗脫下的物質(zhì)具有最強的抗硅藻附著活性。5）半制備色譜分離:用恒定90％的甲醇作流動相洗脫，得到三個片段，片段1和片段2有著較高的質(zhì)量和純度。對洗脫下的物質(zhì)進行活性追蹤，結(jié)果表明三個片段活性都較高。
　　6.對分離得到的片段1和片段2進行結(jié)構(gòu)鑒定。核磁共振波譜分析和氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果顯示，片段1和片段2由于其中的化合物極性相近且較小，難以達到徹底分離的目的。根據(jù)氣質(zhì)聯(lián)用譜庫檢索推測出的化合物純品活性測定，并結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用和核磁共振譜