陸地棉細胞質(zhì)雄性不育及其恢復(fù)機制的研究.pdf

1、植物細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的遺傳現(xiàn)象，在植物雜種優(yōu)勢利用中具有重要價值。棉花細胞質(zhì)雄性由于不育機理尚不清楚，恢復(fù)基因也未得到克隆等原因，同玉米、水稻等作物雄性不育研究相比，要遠遠落后。因此，開展棉花細胞質(zhì)雄性不育的分子機理研究，便于更好的利用棉花雜種優(yōu)勢，具有重要的理論和實踐意義。哈克尼西棉(Gossypiumharknessii Brandegee)細胞

2、質(zhì)雄性不育是由細胞質(zhì)基因控制的并可被核恢復(fù)基因抑制的性狀，其花藥在造抱細胞增殖期就開始退化，并在花粉母細胞減數(shù)分裂時期達敗育高峰，進而花粉母細胞不能形成四分體，是一種無花粉粒的雄性不育。這種雄性細胞退化早、敗育過程清晰和凋亡徹底的花藥，既是雜交棉制種的有利條件，也是雄性不育機理研究的良好材料。
　　 為此，本文以細胞質(zhì)來自哈克尼西棉的陸地棉細胞質(zhì)雄性不育系104-7A和保持系中棉所12、恢復(fù)系02-613-2R、F1(104-7

3、A×02-613-2R)花藥為材料，通過cDNA-AFLP以及線粒體差異蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，鑒定與棉花細胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)相關(guān)的基因與蛋白，并探討細胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)產(chǎn)生的可能機理。研究主要結(jié)果如下：
　　 1.分別利用蔗糖、Percoll和Nycdenze密度梯度離心分離棉花花藥線粒體。通過線粒體標(biāo)志酶活力測定和透射電鏡觀測鑒定線粒體的純度和完整性，最終建立一套以蔗糖為介質(zhì)的密度梯度離心，從包括冷凍花藥等各種棉花組織中分離高純度

4、的完整線粒體的方法。
　　 2.利用cDNA-AFLP技術(shù)，分析了棉花胞質(zhì)雄性不育系、保持系、恢復(fù)系和F1開花前8天花藥的基因表達譜及其差異，結(jié)果表明：不育系花藥的基因表達譜與其“同核異質(zhì)”的保持系之間存在著巨大的差異，提示細胞質(zhì)基因?qū)毎嘶虻谋磉_有調(diào)控作用?；謴?fù)基因引入到不育系獲得F1，其花藥的基因表達譜與正?？捎ㄋ幭嗨?，與恢復(fù)系基本相同，核內(nèi)恢復(fù)基因可以反作用于細胞質(zhì)不育基因?qū)嘶虮磉_的調(diào)控機制，恢復(fù)花粉的育性。CM

5、S基因?qū)嘶虮磉_的調(diào)控作用以及恢復(fù)基因?qū)@種作用的逆轉(zhuǎn)可能是棉花細胞質(zhì)雄性不育及其恢復(fù)的重要原因。另外，我們還鑒定了36個在恢復(fù)系和F1優(yōu)勢表達而在不育系和保持系中不表達或者微量表達的cDNA擴增片段，為恢復(fù)相關(guān)基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.應(yīng)用2-DE和質(zhì)譜鑒定為基礎(chǔ)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分別研究了CMS不育系與可育系的線粒體蛋白質(zhì)差異表達，以及CMS不育系與恢復(fù)系的線粒體蛋白質(zhì)差異。經(jīng)PDQuest軟件分析，我們共獲得

6、了46個與育性相關(guān)的蛋白和1個與恢復(fù)相關(guān)的蛋白，通過MALDI-TOF-TOF MS串聯(lián)質(zhì)譜分析，成功鑒定了34個與育性相關(guān)蛋白和1個與恢復(fù)相關(guān)蛋白。
　　 育性相關(guān)的34個蛋白，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索，劃分為5類，分別為：能量代謝相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)加工相關(guān)蛋白、激素合成相關(guān)蛋白、緩解細胞毒素相關(guān)蛋白和其他蛋白。它們從蛋白質(zhì)水平上證明了棉花細胞質(zhì)雄性不育主要與能量代謝、蛋白質(zhì)加工、ABA合成、活性氧等有關(guān)。
　　 ATP酶是生物體能